Ang Alzheimer's disease (AD) ay kulang sa mga biomarker ng protina na sumasalamin sa maramihang pinagbabatayan nitong pathophysiology, na humahadlang sa pag-unlad ng diagnosis at paggamot. Dito, gumagamit kami ng komprehensibong proteomics upang matukoy ang mga biomarker ng cerebrospinal fluid (CSF) na kumakatawan sa isang malawak na hanay ng AD pathophysiology. Kinilala ng multiplex mass spectrometry ang humigit-kumulang 3,500 at humigit-kumulang 12,000 na protina sa AD CSF at sa utak, ayon sa pagkakabanggit. Ang pagtatasa ng network ng proteome ng utak ay nalutas ang 44 na biodiversity module, 15 sa mga ito ay nag-overlap sa cerebrospinal fluid proteome. Ang mga marker ng CSF AD sa mga magkakapatong na module na ito ay nakatiklop sa limang pangkat ng protina, na kumakatawan sa iba't ibang mga proseso ng pathophysiological. Ang mga synapses at metabolites sa utak ng AD ay bumababa, ngunit ang CSF ay tumataas, habang ang glial-rich myelination at immune group sa utak at CSF ay tumataas. Ang pagkakapare-pareho at pagtitiyak ng sakit ng mga pagbabago sa panel ay nakumpirma sa higit sa 500 karagdagang mga sample ng CSF. Natukoy din ng mga pangkat na ito ang mga biological na subgroup sa asymptomatic AD. Sa pangkalahatan, ang mga resultang ito ay isang promising na hakbang patungo sa mga tool na biomarker na nakabatay sa web para sa mga klinikal na aplikasyon sa AD.
Ang Alzheimer's disease (AD) ay ang pinakakaraniwang sanhi ng neurodegenerative dementia sa buong mundo at nailalarawan sa pamamagitan ng malawak na hanay ng mga biological system dysfunctions, kabilang ang synaptic transmission, glial-mediated immunity, at mitochondrial metabolism (1-3). Gayunpaman, ang mga itinatag na biomarker ng protina ay nakatuon pa rin sa pag-detect ng amyloid at tau na protina, at samakatuwid ay hindi maipapakita ang magkakaibang pathophysiology na ito. Ang mga "core" na biomarker ng protina na ito na pinaka-maaasahang sinusukat sa cerebrospinal fluid (CSF) ay kinabibilangan ng (i) amyloid beta peptide 1-42 (Aβ1-42), na sumasalamin sa pagbuo ng cortical amyloid plaques; (ii) kabuuang tau, isang tanda ng pagkabulok ng axon; (iii) phospho-tau (p-tau), isang kinatawan ng pathological tau hyperphosphorylation (4-7). Bagaman ang mga cerebrospinal fluid biomarker na ito ay lubos na pinadali ang aming pagtuklas ng mga "markahang" AD protein disease (4-7), kinakatawan lamang nila ang isang maliit na bahagi ng kumplikadong biology sa likod ng sakit.
Ang kakulangan ng pathophysiological diversity ng AD biomarkers ay humantong sa maraming mga hamon, kabilang ang (i) ang kawalan ng kakayahan na kilalanin at mabilang ang biological heterogeneity ng mga pasyente ng AD, (ii) hindi sapat na pagsukat ng kalubhaan ng sakit at pag-unlad, lalo na sa preclinical stage, At ( iii) ang pagbuo ng mga therapeutic na gamot na nabigong ganap na malutas ang lahat ng aspeto ng neurological deterioration. Ang aming pag-asa sa landmark na patolohiya upang ilarawan ang AD mula sa mga kaugnay na sakit ay nagpapalala lamang sa mga problemang ito. Parami nang parami ang mga ebidensya na nagpapakita na ang karamihan sa mga matatandang taong may demensya ay may higit sa isang pathological na katangian ng cognitive decline (8). Hanggang sa 90% o higit pa sa mga indibidwal na may AD pathology ay mayroon ding vascular disease, TDP-43 inclusions, o iba pang degenerative na sakit (9). Ang mga mataas na proporsyon ng pathological overlap na ito ay nakagambala sa aming kasalukuyang diagnostic framework para sa demensya, at isang mas komprehensibong pathophysiological na kahulugan ng sakit ay kinakailangan.
Dahil sa agarang pangangailangan para sa iba't ibang AD biomarker, ang larangan ay lalong nagpapatibay ng "omics" na paraan batay sa pangkalahatang sistema upang tumuklas ng mga biomarker. Ang Accelerated Pharmaceutical Partnership (AMP)-AD Alliance ay inilunsad noong 2014 at nasa unahan ng programa. Ang multidisciplinary na pagsisikap na ito ng National Institutes of Health, academia, at industriya ay naglalayong gumamit ng mga diskarte na nakabatay sa sistema upang mas mahusay na tukuyin ang pathophysiology ng AD at bumuo ng biodiversity diagnostic analysis at mga diskarte sa paggamot (10). Bilang bahagi ng proyektong ito, ang network proteomics ay naging isang promising tool para sa pagsulong ng mga biomarker na nakabatay sa system sa AD. Ang walang pinapanigan na data-driven na diskarte na ito ay nag-aayos ng mga kumplikadong set ng data ng proteomics sa mga grupo o "mga module" ng mga co-expressed na protina na nauugnay sa mga partikular na uri ng cell, organelles, at biological function (11-13). Halos 12 impormasyon na mayaman sa network proteomics na pag-aaral ay isinagawa sa AD utak (13-23). Sa pangkalahatan, ang mga pag-aaral na ito ay nagpapahiwatig na ang AD brain network proteome ay nagpapanatili ng isang mataas na conserved modular na organisasyon sa mga independiyenteng cohorts at maraming mga cortical na rehiyon. Bilang karagdagan, ang ilan sa mga modyul na ito ay nagpapakita ng mga maaaring gawing pagbabago sa kasaganaan na nauugnay sa AD sa mga set ng data, na sumasalamin sa pathophysiology ng maraming sakit. Sama-sama, ang mga natuklasan na ito ay nagpapakita ng isang promising anchor point para sa pagtuklas ng proteome ng network ng utak bilang isang biomarker na nakabatay sa system sa AD.
Upang mabago ang proteome ng network ng utak ng AD sa mga klinikal na kapaki-pakinabang na biomarker na nakabatay sa system, pinagsama namin ang network na nagmula sa utak kasama ang pagsusuri ng proteomic ng AD CSF. Ang pinagsamang diskarte na ito ay humantong sa pagkakakilanlan ng limang promising set ng CSF biomarker na nauugnay sa isang malawak na hanay ng pathophysiology na nakabatay sa utak, kabilang ang mga synapses, mga daluyan ng dugo, myelination, pamamaga, at dysfunction ng metabolic pathways. Matagumpay naming napatunayan ang mga panel ng biomarker na ito sa pamamagitan ng maraming pagsusuri sa pagtitiklop, kabilang ang higit sa 500 mga sample ng CSF mula sa iba't ibang mga sakit na neurodegenerative. Kasama sa mga pagsusuri sa pagpapatunay na ito ang pagsusuri sa mga target ng grupo sa CSF ng mga pasyenteng may asymptomatic AD (AsymAD) o nagpapakita ng ebidensya ng abnormal na akumulasyon ng amyloid sa isang normal na kapaligirang nagbibigay-malay. Itinatampok ng mga pagsusuring ito ang makabuluhang biological heterogeneity sa populasyon ng AsymAD at kinikilala ang mga panel marker na maaaring makapag-subtype ng mga indibidwal sa mga pinakaunang yugto ng sakit. Sa pangkalahatan, ang mga resultang ito ay kumakatawan sa isang mahalagang hakbang sa pagbuo ng mga tool ng biomarker ng protina batay sa maraming mga sistema na maaaring matagumpay na malutas ang marami sa mga klinikal na hamon na kinakaharap ng AD.
Ang pangunahing layunin ng pag-aaral na ito ay kilalanin ang mga bagong cerebrospinal fluid biomarker na sumasalamin sa iba't ibang pathophysiology na nakabatay sa utak na humahantong sa AD. Ang Figure S1 ay binabalangkas ang aming pamamaraan ng pananaliksik, na kinabibilangan ng (i) isang komprehensibong pagsusuri na hinimok ng mga paunang natuklasan ng AD CSF at ang network ng proteome ng utak upang makilala ang maramihang mga biomarker ng sakit na CSF na nauugnay sa utak, at (ii) ang kasunod na pagtitiklop Ang mga biomarker na ito ay nasa ilang independiyenteng cerebrospinal fluid cohorts. Ang pananaliksik na nakatuon sa pagtuklas ay nagsimula sa pagsusuri ng differential expression ng CSF sa 20 cognitively normal na indibidwal at 20 AD na pasyente sa Emory Goizueta Alzheimer's Disease Research Center (ADRC). Ang diagnosis ng AD ay tinukoy bilang isang makabuluhang cognitive impairment sa pagkakaroon ng mababang Aβ1-42 at mataas na antas ng kabuuang tau at p-tau sa cerebrospinal fluid [Mean Montreal Cognitive Assessment (MoCA), 13.8 ± 7.0] [ELISA (ELISA) )]] (Talahanayan S1A). Ang kontrol (ibig sabihin MoCA, 26.7 ± 2.2) ay may normal na antas ng mga biomarker ng CSF.
Ang CSF ng tao ay nailalarawan sa pamamagitan ng isang dinamikong hanay ng kasaganaan ng protina, kung saan ang albumin at iba pang napakaraming protina ay maaaring maiwasan ang pagtuklas ng mga protina na interesado (24). Upang madagdagan ang lalim ng pagtuklas ng protina, inalis namin ang unang 14 na lubos na masaganang protina mula sa bawat sample ng CSF bago ang pagsusuri ng mass spectrometry (MS) (24). Isang kabuuan ng 39,805 peptides ang nakilala ng MS, na na-map sa 3691 proteomes sa 40 na mga sample. Ang pag-quantification ng protina ay ginagawa sa pamamagitan ng multiple tandem mass tag (TMT) labeling (18, 25). Upang malutas ang nawawalang data, isinama lamang namin ang mga protina na na-quantified sa hindi bababa sa 50% ng mga sample sa kasunod na pagsusuri, kaya sa wakas ay binibilang ang 2875 na mga proteome. Dahil sa makabuluhang pagkakaiba sa kabuuang mga antas ng kasaganaan ng protina, ang isang control sample ay isinasaalang-alang sa istatistika na isang outlier (13) at hindi kasama sa kasunod na pagsusuri. Ang mga halaga ng kasaganaan ng natitirang 39 na mga sample ay naayos ayon sa edad, kasarian, at batch covariance (13-15, 17, 18, 20, 26).
Gamit ang istatistikal na pagsusuri sa t-test upang suriin ang pagkakaiba-iba ng expression sa set ng data ng regression, ang pagsusuri na ito ay nakilala ang mga protina na ang mga antas ng kasaganaan ay makabuluhang nagbago (P <0.05) sa pagitan ng mga kaso ng kontrol at AD (Talahanayan S2A). Tulad ng ipinapakita sa Figure 1A, ang kasaganaan ng isang kabuuang 225 na protina sa AD ay makabuluhang nabawasan, at ang kasaganaan ng 303 na mga protina ay makabuluhang nadagdagan. Ang mga naiibang ipinahayag na protina na ito ay kinabibilangan ng ilang dating natukoy na cerebrospinal fluid AD marker, tulad ng microtubule-associated protein tau (MAPT; P = 3.52 × 10−8), neurofilament (NEFL; P = 6.56 × 10−3), Protein na nauugnay sa paglago 43 (GAP43; P = 1.46 × 10−5), Fatty Acid Binding Protein 3 (FABP3; P = 2.00 × 10−5), Chitinase 3 like 1 (CHI3L1; P = 4.44 × 10−6), Neural Granulin (NRGN; P = 3.43 × 10−4) at VGF nerve growth factor (VGF; P = 4.83 × 10−3) (4-6). Gayunpaman, natukoy din namin ang iba pang napakahalagang mga target, tulad ng GDP dissociation inhibitor 1 (GDI1; P = 1.54 × 10-10) at modular calcium binding 1 na nauugnay sa SPARC (SMOC1; P = 6.93 × 10-9). Ang pagsusuri ng Gene Ontology (GO) ng 225 na makabuluhang nabawasan na mga protina ay nagsiwalat ng malapit na koneksyon sa mga proseso ng likido sa katawan tulad ng metabolismo ng steroid, coagulation ng dugo, at aktibidad ng hormone (Larawan 1B at Talahanayan S2B). Sa kaibahan, ang makabuluhang pagtaas ng protina ng 303 ay malapit na nauugnay sa istraktura ng cell at metabolismo ng enerhiya.
(A) Ang bulkan plot ay nagpapakita ng log2 fold change (x-axis) na may kaugnayan sa -log10 statistical P value (y-axis) na nakuha ng t-test, na ginagamit upang makita ang differential expression sa pagitan ng control (CT) at AD kaso ng CSF proteome Ng lahat ng mga protina. Ang mga protina na may makabuluhang nabawasang antas (P <0.05) sa AD ay ipinapakita sa kulay asul, habang ang mga protina na may makabuluhang pagtaas ng antas sa sakit ay ipinapakita sa pula. Ang napiling protina ay may label. (B) Ang mga nangungunang termino ng GO na nauugnay sa protina ay makabuluhang nabawasan (asul) at nadagdagan (pula) sa AD. Ipinapakita ang tatlong termino ng GO na may pinakamataas na z-score sa mga larangan ng biological na proseso, molecular function, at cellular na bahagi. (C) Sinukat ng MS ang antas ng MAPT sa sample ng CSF (kaliwa) at ang ugnayan nito sa sample na antas ng ELISA tau (kanan). Ang Pearson correlation coefficient na may kaugnay na P value ay ipinapakita. Dahil sa kakulangan ng data ng ELISA para sa isang kaso ng AD, kasama sa mga numerong ito ang mga halaga para sa 38 sa 39 na nasuri na mga kaso. (D) Ang pinangangasiwaang pagsusuri ng kumpol (P <0.0001, Benjamini-Hochberg (BH) ay inayos ang P <0.01) sa kontrol at ang AD CSF ay nakahanap ng mga sample gamit ang 65 na pinakamahalagang nagbago ng mga protina sa set ng data. I-standardize, gawing normal.
Ang antas ng proteomic ng MAPT ay malapit na nauugnay sa independiyenteng sinusukat na antas ng ELISA tau (r = 0.78, P = 7.8 × 10-9; Figure 1C), na sumusuporta sa bisa ng aming pagsukat sa MS. Matapos ang pagtunaw ng trypsin sa antas ng amyloid precursor protein (APP), ang mga isoform-specific na peptides na naka-mapa sa C-terminus ng Aβ1-40 at Aβ1-42 ay hindi mai-ionize nang mahusay (27, 28). Samakatuwid, ang mga peptide ng APP na natukoy namin ay walang kinalaman sa mga antas ng ELISA Aβ1-42. Upang masuri ang pagkakaiba-iba ng pagpapahayag ng bawat kaso, gumamit kami ng mga naiibang ipinahayag na protina na may P <0.0001 [false discovery rate (FDR) na naitama ang P <0.01] upang magsagawa ng isang pinangangasiwaang pagsusuri ng kumpol ng mga sample (Talahanayan S2A). Tulad ng ipinapakita sa Figure 1D, ang 65 na mataas na makabuluhang protina na ito ay maaaring wastong kumpol ng mga sample ayon sa estado ng sakit, maliban sa isang kaso ng AD na may mga katangiang tulad ng kontrol. Sa 65 na protinang ito, 63 ang tumaas noong AD, habang dalawa lamang (CD74 at ISLR) ang nabawasan. Sa kabuuan, ang mga pagsusuri sa cerebrospinal fluid na ito ay nakilala ang daan-daang mga protina sa AD na maaaring magsilbi bilang mga biomarker ng sakit.
Pagkatapos ay nagsagawa kami ng isang independiyenteng pagsusuri sa network ng AD brain proteome. Kasama sa brain cohort ng pagtuklas na ito ang dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC) mula sa control (n = 10), Parkinson's disease (PD; n = 10), mixed AD/PD (n = 10) at AD (n = 10) na mga kaso. ) Halimbawa. Emery Goizueta ADRC. Ang mga demograpiko ng 40 kaso na ito ay naunang inilarawan (25) at na-summarize sa Talahanayan S1B. Ginamit namin ang TMT-MS upang pag-aralan ang 40 na mga tisyu ng utak na ito at ang replication cohort ng 27 na mga kaso. Sa kabuuan, ang dalawang set ng data ng utak na ito ay gumawa ng 227,121 natatanging peptide, na na-map sa 12,943 na mga proteome (25). Tanging ang mga protina na na-quantified sa hindi bababa sa 50% ng mga kaso ang kasama sa mga kasunod na pagsisiyasat. Ang huling hanay ng data ng pagtuklas ay naglalaman ng 8817 quantified na protina. Isaayos ang mga antas ng kasaganaan ng protina batay sa edad, kasarian, at post-mortem interval (PMI). Ang pagsusuri ng pagkakaiba-iba ng expression ng set ng data pagkatapos ng regression ay nagpakita na ang> 2000 na mga antas ng protina ay makabuluhang nabago [P <0.05, pagsusuri ng pagkakaiba-iba (ANOVA)] sa dalawa o higit pang mga cohorts ng sakit. Pagkatapos, nagsagawa kami ng isang pinangangasiwaang pagsusuri ng kumpol batay sa mga naiibang ipinahayag na protina, at P <0.0001 sa AD / control at / o AD / PD na mga paghahambing (Larawan S2, A at B, Talahanayan S2C). Ang 165 na lubos na binagong mga protina na ito ay malinaw na naglalarawan ng mga kaso na may patolohiya ng AD mula sa mga sample ng control at PD, na nagpapatunay sa malakas na mga pagbabago na partikular sa AD sa buong proteome.
Pagkatapos ay gumamit kami ng algorithm na tinatawag na Weighted Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA) upang magsagawa ng pagsusuri sa network sa natuklasang proteome ng utak, na nag-aayos ng set ng data sa mga module ng protina na may katulad na mga pattern ng expression (11-13). Tinukoy ng pagsusuri ang 44 na mga module (M) na co-expressed na protina, pinagsunod-sunod at binilang mula sa pinakamalaking (M1, n = 1821 na protina) hanggang sa pinakamaliit (M44, n = 34 na protina) (Larawan 2A at Talahanayan S2D) ). Tulad ng nabanggit sa itaas (13) Kalkulahin ang profile ng representasyon ng expression o katangian ng protina ng bawat module, at iugnay ito sa estado ng sakit at patolohiya ng AD, iyon ay, itatag ang alyansa ng Alzheimer's Disease Registry (CERAD) at Braak Score (Figure 2B). Sa pangkalahatan, 17 na mga module ay makabuluhang nauugnay sa AD neuropathology (P <0.05). Marami sa mga module na may kaugnayan sa sakit na ito ay mayaman din sa mga marker na partikular sa uri ng cell (Larawan 2B). Tulad ng nabanggit sa itaas (13), ang pagpapayaman ng uri ng cell ay natutukoy sa pamamagitan ng pagsusuri sa overlap ng module at ang listahan ng sanggunian ng mga gene na partikular sa uri ng cell. Ang mga gene na ito ay nagmula sa nai-publish na data sa mga nakahiwalay na mouse neuron, endothelial at glial cells. Eksperimento sa RNA sequencing (RNA-seq) (29).
(A) Tuklasin ang WGCNA ng proteome ng utak. (B) Pagsusuri ng Biweight midcorrelation (BiCor) ng modular signature protein (ang unang pangunahing bahagi ng modular protein expression) na may mga katangiang neuropathological ng AD (tuktok), kabilang ang mga marka ng CERAD (Aβ plaque) at Braak (tau tangles). Ang intensity ng positibo (pula) at negatibong (asul) na mga ugnayan ay ipinapakita ng isang dalawang-kulay na mapa ng init, at ang mga asterisk ay nagpapahiwatig ng istatistikal na kahalagahan (P <0.05). Gamitin ang Hypergeometric Fisher's Exact Test (FET) (ibaba) upang masuri ang uri ng cell association ng bawat module ng protina. Ang intensity ng red shading ay nagpapahiwatig ng antas ng pagpapayaman ng uri ng cell, at ang asterisk ay nagpapahiwatig ng istatistikal na kahalagahan (P <0.05). Gamitin ang paraan ng BH upang itama ang halaga ng P na nagmula sa FET. (C) pagsusuri ng GO ng mga modular na protina. Ang pinaka malapit na nauugnay na biological na proseso ay ipinapakita para sa bawat module o kaugnay na grupo ng module. oligo, oligodendrocyte.
Ang isang hanay ng limang malapit na nauugnay na astrocyte at microglia-rich modules (M30, M29, M18, M24, at M5) ay nagpakita ng isang malakas na positibong ugnayan sa AD neuropathology (Larawan 2B). Ang pagsusuri sa ontolohiya ay nag-uugnay sa mga glial module na ito sa paglaki ng cell, paglaganap, at kaligtasan sa sakit (Larawan 2C at Talahanayan S2E). Dalawang karagdagang glial modules, M8 at M22, ay malakas din ang upregulated sa sakit. Ang M8 ay lubos na nauugnay sa Toll-like receptor pathway, isang signaling cascade na gumaganap ng mahalagang papel sa likas na immune response (30). Kasabay nito, ang M22 ay malapit na nauugnay sa post-translational modification. Ang M2, na mayaman sa oligodendrocytes, ay nagpapakita ng isang malakas na positibong ugnayan sa AD pathology at isang ontological na koneksyon sa nucleoside synthesis at DNA replication, na nagpapahiwatig ng pinahusay na paglaganap ng cell sa mga sakit. Sa pangkalahatan, sinusuportahan ng mga natuklasang ito ang pagtaas ng mga glial module na dati nating naobserbahan sa AD network proteome (13, 17). Kasalukuyang natagpuan na maraming mga module ng glial na nauugnay sa AD sa network ay nagpapakita ng mas mababang antas ng pagpapahayag sa kontrol at mga kaso ng PD, na binibigyang-diin ang kanilang pagtutukoy ng sakit na nakataas sa AD (Figure S2C).
Apat na module lamang sa aming network proteome (M1, M3, M10, at M32) ang malakas na nakakaugnay sa AD pathology (P <0.05) (Larawan 2, B at C). Parehong M1 at M3 ay mayaman sa neuronal marker. Ang M1 ay lubos na nauugnay sa mga synaptic na signal, habang ang M3 ay malapit na nauugnay sa mitochondrial function. Walang katibayan ng pagpapayaman ng uri ng cell para sa M10 at M32. Sinasalamin ng M32 ang koneksyon sa pagitan ng M3 at metabolismo ng cell, habang ang M10 ay lubos na nauugnay sa paglaki ng cell at pag-andar ng microtubule. Kung ikukumpara sa AD, lahat ng apat na module ay nadagdagan sa kontrol at PD, na nagbibigay sa kanila ng mga pagbabago sa AD na partikular sa sakit (Figure S2C). Sa pangkalahatan, sinusuportahan ng mga resultang ito ang nabawasan na kasaganaan ng mga module na mayaman sa neuron na dati nating naobserbahan sa AD (13, 17). Sa buod, ang pagsusuri sa network ng proteome ng utak na natuklasan namin ay gumawa ng mga module na partikular na binago ng AD na naaayon sa aming mga nakaraang natuklasan.
Ang AD ay nailalarawan sa pamamagitan ng isang maagang yugto ng asymptomatic (AsymAD), kung saan ang mga indibidwal ay nagpapakita ng akumulasyon ng amyloid nang walang pagbagsak ng klinikal na cognitive (5, 31). Ang asymptomatic stage na ito ay kumakatawan sa isang kritikal na window para sa maagang pagtuklas at interbensyon. Nauna naming ipinakita ang malakas na modular na pangangalaga ng AsymAD at AD na proteome ng network ng utak sa mga independiyenteng set ng data (13, 17). Upang matiyak na ang network ng utak na kasalukuyang natuklasan namin ay naaayon sa mga naunang natuklasang ito, sinuri namin ang pangangalaga ng 44 na mga module sa replicated na set ng data mula sa 27 na organisasyon ng DLPFC. Kasama sa mga organisasyong ito ang mga kaso ng kontrol (n = 10), AsymAD (n = 8) At AD (n = 9). Ang mga sample ng control at AD ay kasama sa pagsusuri ng aming cohort ng utak ng pagtuklas (Table S1B), habang ang mga kaso ng AsymAD ay natatangi lamang sa cohort ng pagtitiklop. Ang mga kaso ng AsymAD na ito ay nagmula rin sa Emory Goizueta ADRC brain bank. Bagaman normal ang cognition sa oras ng kamatayan, ang mga antas ng amyloid ay abnormal na mataas (ibig sabihin CERAD, 2.8 ± 0.5) (Talahanayan S1B).
Ang pagsusuri ng TMT-MS sa 27 na tisyu ng utak na ito ay nagresulta sa dami ng 11,244 na mga proteome. Ang panghuling bilang na ito ay kinabibilangan lamang ng mga protinang na-quantify sa hindi bababa sa 50% ng mga sample. Ang replicated na set ng data na ito ay naglalaman ng 8638 (98.0%) ng 8817 na mga protina na nakita sa aming pagtuklas ng pagsusuri sa utak, at may halos 3000 na makabuluhang nagbago ng mga protina sa pagitan ng control at AD cohorts (P <0.05, pagkatapos ng ipinares na t test ni Tukey para sa pagsusuri ng pagkakaiba-iba) ( Talahanayan S2F). Kabilang sa mga naiibang ipinahayag na protina na ito, ang 910 ay nagpakita rin ng mga makabuluhang pagbabago sa antas sa pagitan ng AD at mga kaso ng kontrol ng proteome ng utak (P <0.05, pagkatapos ng ANOVA Tukey na ipinares na t-test). Kapansin-pansin na ang mga 910 marker na ito ay lubos na pare-pareho sa direksyon ng pagbabago sa pagitan ng mga proteome (r = 0.94, P <1.0 × 10-200) (Larawan S3A). Kabilang sa mga tumaas na protina, ang mga protina na may pinaka-pare-parehong pagbabago sa pagitan ng mga set ng data ay pangunahing mga miyembro ng glial-rich M5 at M18 modules (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1, at GFAP). Kabilang sa mga pinababang protina, ang mga may pinaka-pare-parehong pagbabago ay halos eksklusibong miyembro ng M1 module (NPTX2, VGF, at RPH3A) na nauugnay sa synapse. Mas napatunayan pa namin ang mga pagbabagong nauugnay sa AD ng midkine (MDK), CD44, sikretong frizzled-related protein 1 (SFRP1) at VGF sa pamamagitan ng western blotting (Figure S3B). Ang pagsusuri sa pagpapanatili ng module ay nagpakita na ang tungkol sa 80% ng mga module ng protina (34/44) sa proteome ng utak ay makabuluhang natipid sa set ng data ng pagtitiklop (z-score> 1.96, naitama ng FDR ang P <0.05) (Figure S3C). Labing-apat sa mga modyul na ito ay espesyal na nakalaan sa pagitan ng dalawang proteome (z-score> 10, naitama ng FDR ang P <1.0 × 10−23). Sa pangkalahatan, ang pagtuklas at pagtitiklop ng mataas na antas ng pagkakapare-pareho sa pagpapahayag ng kaugalian at modular na komposisyon sa pagitan ng proteome ng utak ay nagtatampok sa muling paggawa ng mga pagbabago sa mga protina ng AD frontal cortex. Bilang karagdagan, kinumpirma din nito na ang AsymAD at mas advanced na mga sakit ay may katulad na istraktura ng network ng utak.
Ang isang mas detalyadong pagsusuri ng pagkakaiba-iba ng expression sa set ng data ng pagtitiklop ng utak ay nagpapakita ng makabuluhang antas ng mga pagbabago sa protina ng AsymAD, kabilang ang isang kabuuang 151 na makabuluhang nagbago ng mga protina sa pagitan ng AsymAD at ang kontrol (P <0.05) (Larawan S3D). Alinsunod sa pag-load ng amyloid, ang APP sa utak ng AsymAD at AD ay tumaas nang malaki. Ang MAPT ay nagbabago lamang nang malaki sa AD, na naaayon sa tumaas na antas ng mga tangles at ang kilalang ugnayan nito sa pagbaba ng cognitive (5, 7). Ang mga module na mayaman sa glial (M5 at M18) ay lubos na makikita sa tumaas na mga protina sa AsymAD, habang ang M1 na nauugnay sa neuron ay ang pinakakinatawan ng mga nabawasan na protina sa AsymAD. Marami sa mga AsymAD marker na ito ay nagpapakita ng mas malaking pagbabago sa mga sintomas na sakit. Kabilang sa mga marker na ito ay ang SMOC1, isang glial protein na kabilang sa M18, na nauugnay sa mga tumor sa utak at pag-unlad ng mga mata at paa (32). Ang MDK ay isang heparin-binding growth factor na nauugnay sa paglaki ng cell at angiogenesis (33), isa pang miyembro ng M18. Kung ikukumpara sa control group, ang AsymAD ay tumaas nang malaki, na sinusundan ng mas malaking pagtaas sa AD. Sa kaibahan, ang synaptic protein neuropentraxin 2 (NPTX2) ay makabuluhang nabawasan sa utak ng AsymAD. Ang NPTX2 ay dating nauugnay sa neurodegeneration at may kinikilalang papel sa pag-mediate ng excitatory synapses (34). Sa pangkalahatan, ang mga resultang ito ay nagpapakita ng iba't ibang mga pagbabago sa preclinical na protina sa AD na tila umuunlad sa kalubhaan ng sakit.
Dahil nakamit namin ang isang makabuluhang lalim ng saklaw ng protina sa pagtuklas ng proteome ng utak, sinusubukan naming maunawaan nang mas ganap ang overlap nito sa network-level AD transcriptome. Samakatuwid, inihambing namin ang proteome ng utak na natuklasan namin sa module na dati naming nabuo mula sa pagsukat ng microarray ng 18,204 na mga gene sa AD (n = 308) at kontrol (n = 157) na mga tisyu ng DLPFC (13). nagsasapawan. Sa kabuuan, nakilala namin ang 20 iba't ibang mga module ng RNA, na marami sa mga ito ay nagpakita ng pagpapayaman ng mga tiyak na uri ng cell, kabilang ang mga neuron, oligodendrocytes, astrocytes, at microglia (Larawan 3A). Ang maraming pagbabago ng mga module na ito sa AD ay ipinapakita sa Figure 3B. Alinsunod sa aming nakaraang pagtatasa ng overlap na protina-RNA gamit ang mas malalim na walang label na MS proteome (mga 3000 protina) (13), karamihan sa 44 na mga module sa network ng proteome ng utak na nakita namin ay nasa transcriptome network Walang makabuluhang overlap sa. Kahit na sa ang aming pagtuklas at pagtitiklop ng 34 na mga module ng protina na lubos na napanatili sa proteome ng utak, 14 lamang (~ 40%) ang pumasa sa eksaktong pagsubok ni Fisher (FET) na napatunayang may makabuluhang pagsasanib ng istatistika sa transcriptome (Larawan 3A). Compatible sa DNA damage repair (P-M25 at P-M19), protein translation (P-M7 at P-M20), RNA binding/splicing (P-M16 at P-M21) at protein targeting (P-M13 at P- M23) ay hindi nagsasapawan sa mga module sa transcriptome. Samakatuwid, kahit na ang isang mas malalim na set ng data ng proteome ay ginagamit sa kasalukuyang pagsusuri ng overlap (13), karamihan sa AD network proteome ay hindi nakamapa sa transcriptome network.
(A) Ang Hypergeometric FET ay nagpapakita ng pagpapayaman ng mga marker na partikular sa uri ng cell sa RNA module ng AD transcriptome (itaas) at ang antas ng overlap sa pagitan ng RNA (x-axis) at protina (y-axis) na mga module ng AD brain (ibaba). Ang intensity ng red shading ay nagpapahiwatig ng antas ng pagpapayaman ng mga uri ng cell sa tuktok na panel at ang intensity ng overlap ng mga module sa ilalim na panel. Ang mga asterisk ay nagpapahiwatig ng istatistikal na kahalagahan (P <0.05). (B) Ang antas ng ugnayan sa pagitan ng mga katangiang gen ng bawat transcriptome module at katayuan ng AD. Ang mga module sa kaliwa ay ang pinaka-negatibong nauugnay sa AD (asul), at ang mga nasa kanan ay ang pinaka-positibong nauugnay sa AD (pula). Ang log-transformed BH-corrected P value ay nagpapahiwatig ng antas ng istatistikal na kahalagahan ng bawat ugnayan. (C) Mga makabuluhang overlapping na module na may nakabahaging pagpapayaman ng uri ng cell. (D) Pagsusuri ng ugnayan ng pagbabago ng log2 fold ng may label na protina (x-axis) at RNA (y-axis) sa overlapping na module. Ang Pearson correlation coefficient na may kaugnay na P value ay ipinapakita. Micro, microglia; mga celestial body, astrocytes. CT, kontrol.
Karamihan sa mga magkakapatong na protina at RNA na mga module ay nagbabahagi ng magkatulad na mga profile ng pagpapayaman ng uri ng cell at pare-pareho ang mga direksyon sa pagbabago ng AD (Larawan 3, B at C). Sa madaling salita, ang synapse-related M1 module ng brain proteome (PM1) ay nakamapa sa tatlong neuronal-rich homologous RNA modules (R-M1, R-M9 at R-M16), na nasa AD Parehong ipinakita. isang pinababang antas. Katulad nito, ang glial-rich M5 at M18 protein modules ay nagsasapawan sa RNA modules na mayaman sa mga astrocytes at microglial marker (R-M3, R-M7, at R-M10) at lubos na kasangkot sa mga sakit na Pagtaas. Ang mga nakabahaging modular na tampok na ito sa pagitan ng dalawang set ng data ay higit pang sumusuporta sa pagpapayaman ng uri ng cell at mga pagbabagong nauugnay sa sakit na naobserbahan namin sa proteome ng utak. Gayunpaman, napansin namin ang maraming makabuluhang pagkakaiba sa pagitan ng mga antas ng RNA at protina ng mga indibidwal na marker sa mga nakabahaging module na ito. Ang pagsusuri ng ugnayan ng pagkakaiba-iba ng pagpapahayag ng mga proteomics at transcriptomics ng mga molekula sa loob ng mga magkakapatong na module na ito (Larawan 3D) ay nagtatampok sa hindi pagkakapare-pareho na ito. Halimbawa, ang APP at ilang iba pang mga glial module protein (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1, at SFRP1) ay nagpakita ng isang makabuluhang pagtaas sa AD proteome, ngunit halos walang pagbabago sa AD transcriptome. Ang mga pagbabagong ito na partikular sa protina ay maaaring malapit na nauugnay sa amyloid plaques (23, 35), na itinatampok ang proteome bilang pinagmumulan ng mga pagbabago sa pathological, at ang mga pagbabagong ito ay maaaring hindi maipakita sa transcriptome.
Pagkatapos ng independiyenteng pagsusuri sa utak at mga proteome ng CSF na natuklasan namin, nagsagawa kami ng isang komprehensibong pagsusuri ng dalawang set ng data upang makilala ang mga biomarker ng AD CSF na nauugnay sa pathophysiology ng network ng utak. Dapat muna nating tukuyin ang overlap ng dalawang proteome. Bagaman malawak na tinatanggap na ang CSF ay sumasalamin sa mga neurochemical na pagbabago sa AD brain (4), ang eksaktong antas ng overlap sa pagitan ng AD brain at ng CSF proteome ay hindi malinaw. Sa pamamagitan ng paghahambing ng bilang ng mga ibinahaging produkto ng gene na nakita sa aming dalawang proteome, nalaman namin na halos 70% (n = 1936) ng mga protina na natukoy sa cerebrospinal fluid ay binibilang din sa utak (Larawan 4A). Karamihan sa mga magkakapatong na protina na ito (n = 1721) ay nakamapa sa isa sa 44 na co-expression na mga module mula sa set ng data ng utak ng pagtuklas (Larawan 4B). Tulad ng inaasahan, ang anim na pinakamalaking module ng utak (M1 hanggang M6) ay nagpakita ng pinakamalaking halaga ng overlap ng CSF. Gayunpaman, mayroong mas maliliit na module ng utak (halimbawa, M15 at M29) na nakakamit ng hindi inaasahang mataas na antas ng overlap, na mas malaki kaysa sa isang module ng utak na doble ang laki nito. Ito ay nag-uudyok sa amin na magpatibay ng isang mas detalyadong paraan na hinihimok ng istatistika upang kalkulahin ang overlap sa pagitan ng utak at cerebrospinal fluid.
(A at B) Ang mga protina na nakita sa utak ng pagtuklas at mga set ng data ng CSF ay nagsasapawan. Karamihan sa mga magkakapatong na protina na ito ay nauugnay sa isa sa 44 na mga module ng co-expression ng network ng co-expression ng utak. (C) Tuklasin ang overlap sa pagitan ng cerebrospinal fluid proteome at ng brain network proteome. Ang bawat row ng heat map ay kumakatawan sa isang hiwalay na overlap analysis ng hypergeometric FET. Inilalarawan ng itaas na row ang overlap (gray/black shading) sa pagitan ng brain module at ng buong CSF proteome. Ang pangalawang linya ay naglalarawan na ang magkakapatong sa pagitan ng mga module ng utak at protina ng CSF (na may kulay na pula) ay makabuluhang naayos sa AD (P <0.05). Ang ikatlong hilera ay nagpapakita na ang overlap sa pagitan ng mga module ng utak at CSF protein (asul na pagtatabing) ay makabuluhang down-regulated sa AD (P <0.05). Gamitin ang paraan ng BH upang itama ang halaga ng P na nagmula sa FET. (D) Folding module panel batay sa cell type association at kaugnay na GO terms. Ang mga panel na ito ay naglalaman ng kabuuang 271 na protina na nauugnay sa utak, na may makabuluhang pagpapahayag ng pagkakaiba-iba sa CSF proteome.
Gamit ang mga single-tailed FET, sinuri namin ang kahalagahan ng overlap ng protina sa pagitan ng CSF proteome at indibidwal na mga module ng utak. Ang pagsusuri ay nagsiwalat na ang kabuuang 14 na mga module ng utak sa set ng data ng CSF ay may makabuluhang mga overlap sa istatistika (FDR adjusted P <0.05), at isang karagdagang module (M18) na ang overlap ay malapit sa kahalagahan (FDR adjusted P = 0.06) (Figure 4C , itaas na hilera). Interesado din kami sa mga module na malakas na nagsasapawan sa mga naiibang ipinahayag na protina ng CSF. Samakatuwid, naglapat kami ng dalawang karagdagang pagsusuri sa FET upang matukoy kung alin sa (i) CSF protein ang makabuluhang nadagdagan sa AD at (ii) CSF protein ay makabuluhang nabawasan sa AD (P <0.05, ipinares na t test AD/control) Mga module ng utak na may makabuluhang overlap sa pagitan nila. Tulad ng ipinapakita sa gitna at ibabang mga hilera ng Figure 4C, ang mga karagdagang pagsusuri na ito ay nagpapakita na ang 8 sa 44 na mga module ng utak ay makabuluhang nagsasapawan sa protina na idinagdag sa AD CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33, at M38) . ), habang dalawang module lamang (M6 at M15) ang nagpakita ng makabuluhang overlap sa pinababang protina sa AD CSF. Gaya ng inaasahan, lahat ng 10 module ay nasa 15 module na may pinakamataas na overlap sa CSF proteome. Samakatuwid, ipinapalagay namin na ang 15 na mga module na ito ay mga mapagkukunan ng mataas na ani ng mga biomarker ng CSF na nagmula sa utak ng AD.
Tinupi namin ang 15 na magkakapatong na mga module na ito sa limang malalaking panel ng protina batay sa kanilang kalapitan sa diagram ng puno ng WGCNA at ang kanilang kaugnayan sa mga uri ng cell at gene ontology (Larawan 4D). Ang unang panel ay naglalaman ng mga module na mayaman sa mga marker ng neuron at mga protina na nauugnay sa synapse (M1 at M12). Ang synaptic panel ay naglalaman ng kabuuang 94 na protina, at ang mga antas sa CSF proteome ay nagbago nang malaki, na ginagawa itong pinakamalaking pinagmumulan ng mga marker ng CSF na nauugnay sa utak sa limang mga panel. Ang pangalawang pangkat (M6 at M15) ay nagpakita ng malapit na koneksyon sa mga endothelial cell marker at vascular body, tulad ng "wound healing" (M6) at "regulasyon ng humoral immune response" (M15). Ang M15 ay lubos ding nauugnay sa metabolismo ng lipoprotein, na malapit na nauugnay sa endothelium (36). Ang vascular panel ay naglalaman ng 34 CSF marker na may kaugnayan sa utak. Kasama sa ikatlong pangkat ang mga module (M2 at M4) na makabuluhang nauugnay sa mga marker ng oligodendrocyte at paglaganap ng cell. Halimbawa, ang pinakamataas na antas ng ontology na mga tuntunin ng M2 ay kinabibilangan ng "positibong regulasyon ng DNA replication" at "purine biosynthesis process". Samantala, kasama sa M4 ang "glial cell differentiation" at "chromosome segregation". Ang myelination panel ay naglalaman ng 49 CSF marker na nauugnay sa utak.
Ang ikaapat na grupo ay naglalaman ng pinakamaraming module (M30, M29, M18, M24, at M5), at halos lahat ng mga module ay mayaman sa microglia at astrocyte marker. Katulad ng myelination panel, ang ikaapat na panel ay naglalaman din ng mga module (M30, M29, at M18) na malapit na nauugnay sa paglaganap ng cell. Ang iba pang mga module sa pangkat na ito ay lubos na nauugnay sa immunological na mga termino, tulad ng "immune effect process" (M5) at "immune response regulation" (M24). Ang glial immune group ay naglalaman ng 42 CSF marker na nauugnay sa utak. Sa wakas, ang huling panel ay may kasamang 52 na mga marker na nauugnay sa utak sa apat na mga module (M44, M3, M33, at M38), na lahat ay nasa katawan na may kaugnayan sa pag-iimbak ng enerhiya at metabolismo. Ang pinakamalaki sa mga module na ito (M3) ay malapit na nauugnay sa mitochondria at mayaman sa mga marker na partikular sa neuron. Ang M38 ay isa sa mga mas maliit na miyembro ng module sa metabolome na ito at nagpapakita rin ng katamtamang pagtitiyak ng neuron.
Sa pangkalahatan, ang limang panel na ito ay sumasalamin sa isang malawak na hanay ng mga uri at pag-andar ng cell sa AD cortex, at sama-samang naglalaman ng 271 na mga marker ng CSF na nauugnay sa utak (Table S2G). Upang masuri ang bisa ng mga resulta ng MS na ito, ginamit namin ang proximity extension assay (PEA), isang orthogonal antibody-based na teknolohiya na may mga kakayahan sa multiplexing, mataas na sensitivity at specificity, at muling sinuri ang mga sample ng cerebrospinal fluid na nakita namin Isang subset ng 271 biomarker na ito. (n = 36). Ang 36 na target na ito ay nagpapakita ng pagbabago sa AD multiple ng PEA, na malapit na nauugnay sa aming mga natuklasan na batay sa MS (r = 0.87, P = 5.6 × 10-12), Na malakas na napatunayan ang mga resulta ng aming komprehensibong pagsusuri sa MS (Figure S4 ).
Ang mga biyolohikal na tema na binibigyang-diin ng aming limang grupo, mula sa synaptic signaling hanggang sa metabolismo ng enerhiya, ay lahat ay nauugnay sa pathogenesis ng AD (1-3). Samakatuwid, ang lahat ng 15 na mga module na naglalaman ng mga panel na ito ay nauugnay sa patolohiya ng AD sa proteome ng utak na natuklasan namin (Larawan 2B). Ang pinaka-kapansin-pansin ay ang mataas na positibong pathological correlation sa pagitan ng aming glial modules at ang malakas na negatibong pathological correlation sa pagitan ng aming pinakamalaking neuronal modules (M1 at M3). Ang pagsusuri ng pagkakaiba-iba ng expression ng aming kinopya na proteome ng utak (Figure S3D) ay nagha-highlight din ng mga protina na glial na nagmula sa M5 at M18. Sa AsymAD at symptomatic AD, ang pinakamaraming tumaas na glial protein at M1-related synapses Ang protina ay pinakamababa. Ang mga obserbasyong ito ay nagpapahiwatig na ang 271 cerebrospinal fluid marker na natukoy namin sa limang grupo ay nauugnay sa mga proseso ng sakit sa AD cortex, kabilang ang mga nangyayari sa mga unang yugto ng asymptomatic.
Upang mas mahusay na pag-aralan ang direksyon ng pagbabago ng mga protina ng panel sa utak at spinal fluid, iginuhit namin ang mga sumusunod para sa bawat isa sa 15 na magkakapatong na mga module: (i) natagpuan ang antas ng kasaganaan ng module sa set ng data ng utak at (ii) ang module protina Ang pagkakaiba ay ipinahayag sa cerebrospinal fluid (Figure S5). Tulad ng nabanggit kanina, ang WGCNA ay ginagamit upang matukoy ang kasaganaan ng module o katangian na halaga ng protina sa utak (13). Ang mapa ng bulkan ay ginagamit upang ilarawan ang pagkakaiba-iba ng pagpapahayag ng mga modular na protina sa cerebrospinal fluid (AD/control). Ang mga figure na ito ay nagpapakita na ang tatlo sa limang mga panel ay nagpapakita ng iba't ibang mga uso sa pagpapahayag sa utak at spinal fluid. Ang dalawang mga module ng synapse panel (M1 at M12) ay nagpapakita ng pagbaba sa antas ng kasaganaan sa utak ng AD, ngunit makabuluhang magkakapatong sa tumaas na protina sa AD CSF (Figure S5A). Ang mga module na nauugnay sa neuron na naglalaman ng metabolome (M3 at M38) ay nagpakita ng magkatulad na mga pattern ng expression ng utak at cerebrospinal fluid na hindi naaayon (Larawan S5E). Ang vascular panel ay nagpakita din ng iba't ibang mga uso sa pagpapahayag, kahit na ang mga module nito (M6 at M15) ay katamtamang nadagdagan sa utak ng AD at nabawasan sa may sakit na CSF (Larawan S5B). Ang natitirang dalawang panel ay naglalaman ng malalaking glial network na ang mga protina ay patuloy na kinokontrol sa parehong mga compartment (Larawan S5, C at D).
Pakitandaan na ang mga trend na ito ay hindi karaniwan sa lahat ng mga marker sa mga panel na ito. Halimbawa, ang synaptic panel ay may kasamang ilang mga protina na makabuluhang nabawasan sa AD brain at CSF (Figure S5A). Kabilang sa mga down-regulated na cerebrospinal fluid marker na ito ay ang NPTX2 at VGF ng M1, at chromogranin B ng M12. Gayunpaman, sa kabila ng mga pagbubukod na ito, karamihan sa aming mga synaptic marker ay nakataas sa AD spinal fluid. Sa pangkalahatan, ang mga pagsusuring ito ay nagawang makilala ang mga makabuluhang uso sa istatistika sa mga antas ng utak at cerebrospinal fluid sa bawat isa sa aming limang panel. Itinatampok ng mga uso na ito ang masalimuot at madalas na magkakaibang ugnayan sa pagitan ng pagpapahayag ng protina ng utak at CSF sa AD.
Pagkatapos, gumamit kami ng high-throughput na MS replication analysis (CSF replication 1) upang paliitin ang aming 271 set ng mga biomarker sa pinaka-promising at reproducible na mga target (Larawan 5A). Ang CSF copy 1 ay naglalaman ng kabuuang 96 na sample mula sa Emory Goizueta ADRC, kabilang ang control, AsymAD, at AD cohort (Table S1A). Ang mga kaso ng AD na ito ay nailalarawan sa pamamagitan ng banayad na pagbaba ng cognitive (ibig sabihin MoCA, 20.0 ± 3.8), at ang mga pagbabago sa AD biomarker ay nakumpirma sa cerebrospinal fluid (Table S1A). Taliwas sa pagsusuri ng CSF na aming nahanap, ang pagtitiklop na ito ay ginaganap gamit ang isang mas mahusay at high-throughput na "single-shot" na pamamaraan ng MS (nang walang off-line fractionation), kabilang ang isang pinasimpleng sample preparation protocol na nag-aalis ng pangangailangan para sa immunodepletion ng mga indibidwal na sample . Sa halip, ang isang solong immune-depleted na "channel ng pagpapahusay" ay ginagamit upang palakasin ang signal ng mas kaunting mga protina (37). Bagaman binabawasan nito ang kabuuang saklaw ng proteome, ang pamamaraang single-shot na ito ay makabuluhang binabawasan ang oras ng makina at pinapataas ang bilang ng mga sample na may label na TMT na maaaring masuri na mabubuhay (17, 38). Sa kabuuan, natukoy ng pagsusuri ang 6,487 peptides, na na-mapa sa 1,183 proteome sa 96 na kaso. Tulad ng pagsusuri sa CSF na natagpuan namin, tanging ang mga protina na na-quantified sa hindi bababa sa 50% ng mga sample ang kasama sa kasunod na mga kalkulasyon, at ang data ay na-regressed para sa mga epekto ng edad at kasarian. Ito ay humantong sa panghuling dami ng 792 proteome, 95% nito ay natukoy din sa CSF data set na natagpuan.
(A) Ang mga target na protina ng CSF na nauugnay sa utak ay na-verify sa unang kinopya na CSF cohort at kasama sa panghuling panel (n = 60). (B hanggang E) Mga antas ng biomarker ng panel (composite z-scores) na sinusukat sa apat na CSF replication cohorts. Ang mga ipinares na t-test o ANOVA kasama ang post-correction ni Tukey ay ginamit upang suriin ang istatistikal na kahalagahan ng mga pagbabago sa kasaganaan sa bawat pagsusuri ng pagtitiklop. CT, kontrol.
Dahil partikular na interesado kaming i-verify ang aming 271 na mga target na CSF na nauugnay sa utak sa pamamagitan ng komprehensibong pagsusuri, lilimitahan namin ang karagdagang pagsusuri sa kinopya na proteome na ito sa mga marker na ito. Sa mga 271 na protinang ito, 100 ang nakita sa pagtitiklop ng CSF 1. Ipinapakita ng Figure S6A ang pagkakaiba-iba ng pagpapahayag ng 100 na magkakapatong na mga marker na ito sa pagitan ng kontrol at mga sample ng pagtitiklop ng AD. Ang mga synaptic at metabolite histones ay higit na tumataas sa AD, habang ang mga vascular protein ay pinakamababa sa sakit. Karamihan sa 100 magkakapatong na marker (n = 70) ay nagpapanatili ng parehong direksyon ng pagbabago sa dalawang set ng data (Figure S6B). Ang 70 napatunayan na mga marker ng CSF na nauugnay sa utak (Table S2H) ay higit sa lahat ay sumasalamin sa naunang sinusunod na mga trend ng expression ng panel, iyon ay, ang down-regulation ng mga vascular protein at ang up-regulation ng lahat ng iba pang mga panel. 10 lamang sa 70 napatunayang protina na ito ang nagpakita ng mga pagbabago sa kasaganaan ng AD na sumasalungat sa mga trend ng panel na ito. Upang makabuo ng isang panel na pinakamahusay na sumasalamin sa pangkalahatang takbo ng utak at cerebrospinal fluid, hindi namin isinama ang 10 protina na ito mula sa panel ng interes na sa wakas ay napatunayan namin (Larawan 5A). Samakatuwid, ang aming panel sa huli ay may kasamang kabuuang 60 na protina na na-verify sa dalawang independiyenteng CSF AD cohorts gamit ang iba't ibang paghahanda ng sample at pagsusuri sa MS platform. Ang mga z-score expression plot ng mga huling panel na ito sa CSF copy 1 control at mga kaso ng AD ay nakumpirma ang trend ng panel na naobserbahan sa CSF cohort na aming natagpuan (Larawan 5B).
Kabilang sa 60 protinang ito, may mga molekula na kilala na nauugnay sa AD, tulad ng osteopontin (SPP1), na isang pro-inflammatory cytokine na nauugnay sa AD sa maraming pag-aaral (39-41), at GAP43, Isang synaptic protein. na malinaw na nauugnay sa neurodegeneration (42). Ang pinakaganap na na-verify na mga protina ay ang mga marker na nauugnay sa iba pang sakit na neurodegenerative, gaya ng amyotrophic lateral sclerosis (ALS) na nauugnay sa superoxide dismutase 1 (SOD1) at Parkinson's disease related desaccharase (PARK7) . Na-verify din namin na maraming iba pang mga marker, tulad ng SMOC1 at brain-rich membrane attachment signaling protein 1 (BASP1), ay may limitadong mga nakaraang link sa neurodegeneration. Kapansin-pansin na dahil sa kanilang mababang pangkalahatang kasaganaan sa CSF proteome, mahirap para sa amin na gamitin ang high-throughput na single-shot detection na paraan upang mapagkakatiwalaang makita ang MAPT at ilang iba pang mga protina na nauugnay sa AD (halimbawa, NEFL at NRGN. ) ( 43, 44).
Pagkatapos ay sinuri namin ang 60 na priority panel marker na ito sa tatlong karagdagang pag-uulit na pagsusuri. Sa CSF Copy 2, gumamit kami ng isang TMT-MS upang pag-aralan ang isang independiyenteng cohort ng 297 control at AD sample mula sa Emory Goizueta ADRC (17). Ang pagtitiklop ng CSF 3 ay nagsasama ng isang reanalysis ng magagamit na data ng TMT-MS mula sa 120 control at mga pasyente ng AD mula sa Lausanne, Switzerland (45). Nakakita kami ng higit sa dalawang-katlo ng 60 priority marker sa bawat dataset. Bagaman ang Swiss na pag-aaral ay gumamit ng iba't ibang mga platform ng MS at mga pamamaraan ng dami ng TMT (45, 46), malakas naming ginawa ang aming mga trend ng panel sa dalawang paulit-ulit na pagsusuri (Larawan 5, C at D, at Mga Talahanayan S2, I, at J). Upang masuri ang pagtitiyak ng sakit ng aming grupo, ginamit namin ang TMT-MS upang pag-aralan ang ika-apat na set ng data ng pagtitiklop (pagtitiklop ng CSF 4), na kasama hindi lamang ang mga kaso ng kontrol (n = 18) at AD (n = 17), kundi pati na rin ang PD ( n = 14)), ALS (n = 18) at frontotemporal dementia (FTD) na mga sample (n = 11) (Talahanayan S1A). Matagumpay naming nasukat ang halos dalawang-katlo ng mga protina ng panel sa cohort na ito (38 sa 60). Itinatampok ng mga resultang ito ang mga pagbabagong partikular sa AD sa lahat ng limang mga panel ng biomarker (Larawan 5E at Talahanayan S2K). Ang pagtaas sa pangkat ng metabolite ay nagpakita ng pinakamalakas na pagtutukoy ng AD, na sinusundan ng myelination at glial group. Sa mas maliit na lawak, nagpapakita rin ang FTD ng pagtaas sa pagitan ng mga panel na ito, na maaaring magpakita ng mga katulad na potensyal na pagbabago sa network (17). Sa kaibahan, ang ALS at PD ay nagpakita ng halos parehong myelination, glial, at mga profile ng metabolome bilang control group. Sa pangkalahatan, sa kabila ng mga pagkakaiba sa paghahanda ng sample, platform ng MS, at mga pamamaraan ng quantification ng TMT, ipinapakita ng paulit-ulit na pagsusuring ito na ang aming mga priority panel marker ay may lubos na pare-parehong pagbabagong partikular sa AD sa higit sa 500 natatanging mga sample ng CSF.
Ang AD neurodegeneration ay malawak na kinikilala ilang taon bago ang simula ng mga sintomas ng nagbibigay-malay, kaya mayroong isang kagyat na pangangailangan para sa mga biomarker ng AsymAD (5, 31). Gayunpaman, parami nang parami ang mga ebidensya na nagpapakita na ang biology ng AsymAD ay malayo sa homogenous, at ang kumplikadong pakikipag-ugnayan ng panganib at katatagan ay humahantong sa malalaking indibidwal na pagkakaiba sa kasunod na pag-unlad ng sakit (47). Bagaman ginamit upang matukoy ang mga kaso ng AsymAD, ang mga antas ng mga pangunahing CSF biomarker (Aβ1-42, kabuuang tau at p-tau) ay hindi napatunayang mapagkakatiwalaan na mahulaan kung sino ang uunlad sa demensya (4, 7), na nagpapahiwatig ng higit pa. kinakailangan upang isama ang mga tool ng holistic na biomarker batay sa maraming aspeto ng pisyolohiya ng utak upang tumpak na ma-stratify ang panganib ng populasyon na ito. Samakatuwid, sinuri namin ang aming AD-validated biomarker panel sa populasyon ng AsymAD ng CSF copy 1. Ang 31 na kaso ng AsymAD na ito ay nagpakita ng abnormal na mga antas ng core biomarker (Aβ1–42/total tau ELISA ratio, <5.5) at kumpletong cognition (ibig sabihin MoCA, 27.1 ± 2.2) (Talahanayan S1A). Bilang karagdagan, ang lahat ng mga indibidwal na may AsymAD ay may klinikal na marka ng dementia na 0, na nagpapahiwatig na walang katibayan ng pagbaba sa pang-araw-araw na cognitive o functional na pagganap.
Una naming sinuri ang mga antas ng napatunayang mga panel sa lahat ng 96 na mga replika ng CSF 1, kasama ang AsymAD cohort. Natagpuan namin na ang ilang mga panel sa pangkat ng AsymAD ay may makabuluhang pagbabago sa kasaganaan na tulad ng AD, ang vascular panel ay nagpakita ng isang pababang takbo sa AsymAD, habang ang lahat ng iba pang mga panel ay nagpakita ng isang pataas na kalakaran (Larawan 6A). Samakatuwid, ang lahat ng mga panel ay nagpakita ng isang lubos na makabuluhang ugnayan sa ELISA Aβ1-42 at kabuuang antas ng tau (Larawan 6B). Sa kaibahan, ang ugnayan sa pagitan ng pangkat at ang marka ng MoCA ay medyo mahirap. Ang isa sa mga mas kapansin-pansin na natuklasan mula sa mga pagsusuri na ito ay ang malaking hanay ng mga kasaganaan ng panel sa AsymAD cohort. Tulad ng ipinapakita sa Figure 6A, ang antas ng panel ng pangkat ng AsymAD ay karaniwang tumatawid sa antas ng panel ng control group at ang AD group, na nagpapakita ng medyo mataas na pagkakaiba-iba. Upang higit pang galugarin ang heterogeneity ng AsymAD, inilapat namin ang pagsusuri ng Multidimensional Scaling (MDS) sa 96 CSF replication 1 na kaso. Nagbibigay-daan ang pagsusuri sa MDS na mailarawan ang pagkakatulad sa pagitan ng mga kaso batay sa ilang partikular na variable sa set ng data. Para sa pagsusuri ng kumpol na ito, ginagamit lamang namin ang mga napatunayang panel marker na may makabuluhang pagbabago sa istatistika (P <0.05, AD/kontrol) sa antas ng pagtuklas ng CSF at pagtitiklop 1 proteome (n = 29) (Table S2L). Ang pagsusuri na ito ay gumawa ng malinaw na spatial clustering sa pagitan ng aming kontrol at mga kaso ng AD (Larawan 6C). Sa kaibahan, ang ilang mga kaso ng AsymAD ay malinaw na naka-cluster sa control group, habang ang iba ay matatagpuan sa mga kaso ng AD. Upang higit pang galugarin ang heterogeneity ng AsymAD na ito, ginamit namin ang aming MDS map upang tukuyin ang dalawang grupo ng mga kaso ng AsymAD na ito. Kasama sa unang pangkat ang mga kaso ng AsymAD na kumpol na mas malapit sa kontrol (n = 19), habang ang pangalawang pangkat ay nailalarawan sa mga kaso ng AsymAD na may profile ng marker na mas malapit sa AD (n = 12).
(A) Ang antas ng expression (z-score) ng CSF biomarker group sa lahat ng 96 na sample sa CSF replication 1 cohort, kasama ang AsymAD. Ang pagsusuri ng pagkakaiba-iba sa post-correction ni Tukey ay ginamit upang suriin ang istatistikal na kahalagahan ng mga pagbabago sa kasaganaan ng panel. (B) Correlation analysis ng panel protein abundance level (z-score) na may MoCA score at kabuuang tau level sa ELISA Aβ1-42 at CSF copy 1 samples. Ang Pearson correlation coefficient na may kaugnay na P value ay ipinapakita. (C) Ang MDS ng 96 CSF copy 1 na mga kaso ay batay sa mga antas ng kasaganaan ng 29 validated panel marker, na makabuluhang nabago sa parehong pagtuklas at CSF copy 1 set ng data [P <0.05 AD/control (CT)]. Ginamit ang pagsusuring ito upang hatiin ang pangkat ng AsymAD sa mga subgroup na kontrol (n = 19) at AD (n = 12). (D) Ipinapakita ng plot ng bulkan ang differential expression ng lahat ng CSF replication 1 na protina na may log2 fold change (x-axis) na nauugnay sa -log10 statistical P value sa pagitan ng dalawang AsymAD subgroup. Ang mga biomarker ng panel ay may kulay. (E) Ang pagtitiklop ng CSF 1 na antas ng kasaganaan ng mga biomarker ng pangkat ng pagpili ay naiiba na ipinahayag sa pagitan ng mga subgroup ng AsymAD. Ang post-adjusted analysis ni Tukey ng variance ay ginamit upang masuri ang statistical significance.
Sinuri namin ang pagkakaiba-iba ng pagpapahayag ng protina sa pagitan ng mga kontrol na ito at mga kaso ng AD-tulad ng AsymAD (Larawan 6D at Table S2L). Ang resultang mapa ng bulkan ay nagpapakita na ang 14 na panel marker ay nagbago nang malaki sa pagitan ng dalawang grupo. Karamihan sa mga marker na ito ay mga miyembro ng synapse at metabolome. Gayunpaman, ang SOD1 at myristoylated alanine-rich protein kinase C substrate (MARCKS), na mga miyembro ng myelin at glial immune group, ayon sa pagkakabanggit, ay kabilang din sa pangkat na ito (Larawan 6, D at E). Ang vascular panel ay nag-ambag din ng dalawang marker na makabuluhang nabawasan sa AD-like AsymAD group, kabilang ang AE binding protein 1 (AEBP1) at umakma sa miyembro ng pamilya na C9. Walang makabuluhang pagkakaiba sa pagitan ng control at AD-like AsymAD subgroups sa ELISA AB1-42 (P = 0.38) at p-tau (P = 0.28), ngunit mayroon talagang makabuluhang pagkakaiba sa kabuuang antas ng tau (P = 0.0031). ) (Larawan S7). Mayroong ilang mga panel marker na nagpapahiwatig na ang mga pagbabago sa pagitan ng dalawang subgroup ng AsymAD ay mas makabuluhan kaysa sa kabuuang antas ng tau (halimbawa, YWHAZ, SOD1, at MDH1) (Figure 6E). Sa pangkalahatan, ang mga resultang ito ay nagpapahiwatig na ang aming napatunayang panel ay maaaring maglaman ng mga biomarker na maaaring mag-subtype at potensyal na stratification ng panganib ng mga pasyente na may asymptomatic disease.
Mayroong isang agarang pangangailangan para sa mga tool na biomarker na nakabatay sa system upang mas mahusay na masukat at i-target ang iba't ibang pathophysiology sa likod ng AD. Ang mga tool na ito ay inaasahan na hindi lamang babaguhin ang aming AD diagnostic framework, ngunit i-promote din ang pag-aampon ng mga epektibong diskarte sa paggamot na partikular sa pasyente (1, 2). Sa layuning ito, inilapat namin ang isang walang pinapanigan na komprehensibong diskarte sa proteomics sa AD brain at CSF para matukoy ang mga web-based na CSF biomarker na sumasalamin sa isang malawak na hanay ng pathophysiology na nakabatay sa utak. Ang aming pagsusuri ay gumawa ng limang CSF biomarker panel, na (i) sumasalamin sa mga synapses, mga daluyan ng dugo, myelin, immune at metabolic dysfunction; (ii) nagpapakita ng malakas na reproducibility sa iba't ibang MS platform; (iii) Magpakita ng mga progresibong pagbabagong partikular sa sakit sa buong maaga at huling yugto ng AD. Sa pangkalahatan, ang mga natuklasang ito ay kumakatawan sa isang promising na hakbang tungo sa pagbuo ng magkakaibang, maaasahan, web-oriented na biomarker tool para sa AD na pananaliksik at mga klinikal na aplikasyon.
Ang aming mga resulta ay nagpapakita ng lubos na konserbadong organisasyon ng AD brain network proteome at sinusuportahan ang paggamit nito bilang isang anchor para sa pag-unlad ng biomarker na nakabatay sa system. Ipinapakita ng aming pagsusuri na ang dalawang independiyenteng mga dataset ng TMT-MS na naglalaman ng mga utak ng AD at AsymAD ay may malakas na modularity. Ang mga natuklasang ito ay nagpapalawak sa aming nakaraang gawain, na nagpapakita ng pagpapanatili ng mga makapangyarihang module ng higit sa 2,000 mga tisyu ng utak mula sa maraming independiyenteng cohorts sa frontal, parietal, at temporal cortex (17). Ang consensus network na ito ay sumasalamin sa iba't ibang pagbabagong nauugnay sa sakit na naobserbahan sa kasalukuyang pananaliksik, kabilang ang pagtaas ng glial-rich inflammatory modules at ang pagbaba ng neuron-rich modules. Tulad ng kasalukuyang pananaliksik, ang malakihang network na ito ay nagtatampok din ng mga makabuluhang modular na pagbabago sa AsymAD, na nagpapakita ng iba't ibang mga preclinical pathophysiology (17).
Gayunpaman, sa loob ng lubos na konserbatibong balangkas na nakabatay sa sistema, mayroong higit na pinong biological heterogeneity, lalo na sa mga indibidwal sa mga unang yugto ng AD. Nagagawa ng aming panel ng biomarker na ilarawan ang dalawang subgroup sa AsymAD, na nagpapakita ng makabuluhang pagpapahayag ng pagkakaiba-iba ng maraming mga marker ng CSF. Nagawa ng aming grupo na i-highlight ang mga biological na pagkakaiba sa pagitan ng dalawang subgroup na ito, na hindi halata sa antas ng mga pangunahing AD biomarker. Kung ikukumpara sa control group, ang Aβ1-42/total tau ratios ng mga AsymAD na indibidwal na ito ay abnormal na mababa. Gayunpaman, tanging ang kabuuang antas ng tau ay makabuluhang naiiba sa pagitan ng dalawang subgroup ng AsymAD, habang ang mga antas ng Aβ1-42 at p-tau ay nanatiling medyo maihahambing. Dahil ang mataas na CSF tau ay tila isang mas mahusay na tagahula ng mga sintomas ng cognitive kaysa sa mga antas ng Aβ1-42 (7), pinaghihinalaan namin na ang dalawang AsymAD cohorts ay maaaring magkaroon ng magkakaibang mga panganib ng pag-unlad ng sakit. Dahil sa limitadong laki ng sample ng aming AsymAD at kakulangan ng longitudinal na data, kailangan ang karagdagang pananaliksik upang kumpiyansa na makagawa ng mga konklusyong ito. Gayunpaman, ang mga resultang ito ay nagpapahiwatig na ang isang system-based na panel ng CSF ay maaaring mapahusay ang aming kakayahan na epektibong pagsamahin ang mga indibidwal sa panahon ng asymptomatic na yugto ng sakit.
Sa pangkalahatan, sinusuportahan ng aming mga natuklasan ang papel ng maraming biological na pag-andar sa pathogenesis ng AD. Gayunpaman, ang dysregulated na metabolismo ng enerhiya ay naging kilalang tema ng lahat ng aming limang napatunayang mga panel ng label. Ang mga metabolic protein, tulad ng hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) at lactate dehydrogenase A (LDHA), ay ang pinaka-matibay na napatunayan na synaptic biomarker, na nagpapahiwatig na ang pagtaas sa AD CSF ay lubos na nagagawang kasarian. Ang aming mga daluyan ng dugo at glial panel ay naglalaman din ng ilang mga marker na kasangkot sa metabolismo ng mga oxidative substance. Ang mga natuklasan na ito ay naaayon sa pangunahing papel na ginagampanan ng mga metabolic na proseso sa buong utak, hindi lamang upang matugunan ang mataas na pangangailangan ng enerhiya ng mga neuron, ngunit upang matugunan din ang mataas na pangangailangan ng enerhiya ng mga astrocytes at iba pang mga glial cells (17, 48). Sinusuportahan ng aming mga resulta ang lumalagong ebidensya na ang mga pagbabago sa potensyal na redox at pagkagambala ng mga landas ng enerhiya ay maaaring ang pangunahing link sa pagitan ng ilang mga pangunahing proseso na kasangkot sa pathogenesis ng AD, kabilang ang mga mitochondrial disorder, glial-mediated na pamamaga, at pinsala sa Vascular (49). Bilang karagdagan, ang metabolic cerebrospinal fluid biomarker ay naglalaman ng isang malaking bilang ng mga differentially rich proteins sa pagitan ng aming control at AD-like AsymAD subgroups, na nagmumungkahi na ang pagkagambala ng mga energy at redox pathway na ito ay maaaring kritikal sa preclinical stage ng sakit.
Ang iba't ibang mga uso sa panel ng utak at cerebrospinal fluid na naobserbahan namin ay mayroon ding mga kagiliw-giliw na biological na implikasyon. Ang mga synapses at metabolomes na mayaman sa mga neuron ay nagpapakita ng mga nabawasan na antas sa utak ng AD at tumaas na kasaganaan sa cerebrospinal fluid. Dahil ang mga neuron ay mayaman sa mitochondria na gumagawa ng enerhiya sa mga synapses upang magbigay ng enerhiya para sa kanilang maraming espesyal na signal (50), inaasahan ang pagkakapareho ng mga profile ng expression ng dalawang pangkat ng neuron na ito. Ang pagkawala ng mga neuron at ang pag-extrusion ng mga nasirang cell ay maaaring ipaliwanag ang mga uso sa utak at CSF panel na ito sa susunod na sakit, ngunit hindi nila maipaliwanag ang mga pagbabago sa unang bahagi ng panel na aming naobserbahan (13). Ang isang posibleng paliwanag para sa mga natuklasang ito sa maagang asymptomatic na sakit ay abnormal na synaptic pruning. Ang mga bagong katibayan sa mga modelo ng mouse ay nagmumungkahi na ang microglia-mediated synaptic phagocytosis ay maaaring abnormal na aktibo sa AD at humantong sa maagang pagkawala ng synaps sa utak (51). Ang itinapon na synaptic na materyal na ito ay maaaring maipon sa CSF, kaya naman napansin namin ang pagtaas ng CSF sa neuron panel. Ang immune-mediated synaptic pruning ay maaari ding bahagyang ipaliwanag ang pagtaas ng mga glial protein na naobserbahan natin sa utak at cerebrospinal fluid sa buong proseso ng sakit. Bilang karagdagan sa synaptic pruning, ang mga pangkalahatang abnormalidad sa exocytic pathway ay maaari ring humantong sa iba't ibang mga expression ng utak at CSF ng mga neuronal marker. Ang isang bilang ng mga pag-aaral ay nagpakita na ang nilalaman ng mga exosome sa pathogenesis ng AD utak ay nagbago (52). Ang extracellular pathway ay kasangkot din sa paglaganap ng Aβ (53, 54). Kapansin-pansin na ang pagsugpo sa exosomal na pagtatago ay maaaring mabawasan ang patolohiya na tulad ng AD sa mga modelo ng AD transgenic mouse (55).
Kasabay nito, ang protina sa vascular panel ay nagpakita ng katamtamang pagtaas sa utak ng AD, ngunit makabuluhang nabawasan sa CSF. Maaaring bahagyang ipaliwanag ng blood-brain barrier (BBB) dysfunction ang mga natuklasang ito. Maraming mga independiyenteng postmortem na pag-aaral ng tao ang nagpakita ng pagkasira ng BBB sa AD (56, 57). Kinumpirma ng mga pag-aaral na ito ang iba't ibang abnormal na aktibidad na nakapalibot sa mahigpit na selyadong layer ng endothelial cells, kabilang ang brain capillary leakage at perivascular accumulation ng blood-borne proteins (57). Maaari itong magbigay ng isang simpleng paliwanag para sa mga nakataas na vascular protein sa utak, ngunit hindi nito ganap na maipaliwanag ang pagkaubos ng parehong mga protina sa cerebrospinal fluid. Ang isang posibilidad ay ang central nervous system ay aktibong naghihiwalay sa mga molekula na ito upang malutas ang problema ng tumaas na pamamaga at oxidative stress. Ang pagbawas sa ilan sa mga pinakamalubhang protina ng CSF sa panel na ito, lalo na ang mga kasangkot sa regulasyon ng lipoprotein, ay nauugnay sa pagsugpo sa mga nakakapinsalang antas ng pamamaga at ang proseso ng neuroprotective ng mga reaktibong species ng oxygen. Ito ay totoo para sa Paroxonase 1 (PON1), isang lipoprotein binding enzyme na responsable para sa pagbabawas ng oxidative stress level sa sirkulasyon (58, 59). Ang Alpha-1-microglobulin/bikunin precursor (AMBP) ay isa pang makabuluhang down-regulated na marker ng vascular group. Ito ang pasimula ng bikunin ng transporter ng lipid, na kasangkot din sa pagsugpo sa pamamaga at Proteksyon ng neurological (60, 61).
Sa kabila ng iba't ibang mga kagiliw-giliw na hypotheses, ang kawalan ng kakayahang direktang makita ang mga mekanismo ng biochemical na sakit ay isang kilalang limitasyon ng pagtatasa ng proteomics na hinimok ng pagtuklas. Samakatuwid, ang karagdagang pananaliksik ay kinakailangan upang kumpiyansa na tukuyin ang mga mekanismo sa likod ng mga biomarker panel na ito. Upang lumipat patungo sa pagbuo ng klinikal na pagsusuri na batay sa MS, ang direksyon sa hinaharap ay nangangailangan din ng paggamit ng mga naka-target na pamamaraan ng dami para sa malakihang pag-verify ng biomarker, tulad ng pumipili o parallel na pagsubaybay sa reaksyon (62). Gumamit kami kamakailan ng parallel reaction monitoring (63) upang mapatunayan ang marami sa mga pagbabago sa protina ng CSF na inilarawan dito. Ilang priority panel target ang binibilang na may makabuluhang katumpakan, kabilang ang YWHAZ, ALDOA, at SMOC1, na nagmamapa sa aming synaps, metabolism, at mga panel ng pamamaga, ayon sa pagkakabanggit (63). Ang Independent Data Acquisition (DIA) at iba pang mga diskarte na nakabatay sa MS ay maaari ding maging kapaki-pakinabang para sa pag-verify ng target. Bud et al. (64) Kamakailan ay ipinakita na mayroong isang makabuluhang overlap sa pagitan ng mga biomarker ng AD na natukoy sa aming set ng data ng pagtuklas ng CSF at ang independiyenteng set ng data ng DIA-MS, na binubuo ng halos 200 mga sample ng CSF mula sa tatlong magkakaibang European cohorts . Sinusuportahan ng mga kamakailang pag-aaral na ito ang potensyal ng aming mga panel na mag-transform sa maaasahang MS-based detection. Mahalaga rin ang tradisyonal na antibody at aptamer-based detection para sa karagdagang pag-unlad ng mga pangunahing AD biomarker. Dahil sa mababang kasaganaan ng CSF, mas mahirap tuklasin ang mga biomarker na ito gamit ang mga high-throughput na pamamaraan ng MS. Ang NEFL at NRGN ay dalawang tulad ng mga halimbawa ng mababang-kasaganaan na mga biomarker ng CSF, na naka-mapa sa panel sa aming komprehensibong pagsusuri, ngunit hindi mapagkakatiwalaang matukoy gamit ang aming solong diskarte sa MS. Ang mga diskarte sa pag-target batay sa maraming antibodies, gaya ng PEA, ay maaaring magsulong ng klinikal na pagbabago ng mga marker na ito.
Sa pangkalahatan, ang pag-aaral na ito ay nagbibigay ng isang natatanging diskarte sa proteomics para sa pagkilala at pagpapatunay ng mga biomarker ng CSF AD batay sa iba't ibang mga system. Ang pag-optimize sa mga marker panel na ito sa mga karagdagang AD cohorts at MS platform ay maaaring mapatunayang nangangako na isulong ang AD risk stratification at treatment. Ang mga pag-aaral na sinusuri ang longitudinal na antas ng mga panel na ito sa paglipas ng panahon ay kritikal din upang matukoy kung aling kumbinasyon ng mga marker ang pinakamahusay na nagsa-stratify sa panganib ng maagang sakit at mga pagbabago sa kalubhaan ng sakit.
Maliban sa 3 sample na kinopya ng CSF, lahat ng mga sample ng CSF na ginamit sa pag-aaral na ito ay nakolekta sa ilalim ng auspice ng Emory ADRC o malapit na nauugnay na mga institusyong pananaliksik. Isang kabuuan ng apat na hanay ng mga sample ng Emory CSF ang ginamit sa mga pag-aaral ng proteomics na ito. Ang CSF cohort ay natagpuang naglalaman ng mga sample mula sa 20 malusog na kontrol at 20 AD na mga pasyente. Kasama sa CSF copy 1 ang mga sample mula sa 32 malusog na kontrol, 31 AsymAD na indibidwal, at 33 AD na indibidwal. Ang CSF copy 2 ay naglalaman ng 147 controls at 150 AD sample. Kasama sa multi-disease CSF replication 4 cohort ang 18 controls, 17 AD, 19 ALS, 13 PD, at 11 FTD sample. Ayon sa kasunduan na inaprubahan ng Emory University Institutional Review Board, lahat ng kalahok sa pag-aaral ng Emory ay nakakuha ng kaalamang pahintulot. Ayon sa 2014 National Institute of Aging Best Practice Guidelines para sa Alzheimer's Centers (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html), ang cerebrospinal fluid ay kinolekta at inimbak sa pamamagitan ng lumbar puncture. Ang mga pasyente ng Control at AsymAD at AD ay nakatanggap ng standardized cognitive assessment sa Emory Cognitive Neurology Clinic o Goizueta ADRC. Ang kanilang mga sample ng cerebrospinal fluid ay sinubukan ng INNO-BIA AlzBio3 Luminex para sa ELISA Aβ1-42, kabuuang tau at p-tau analysis (65). Ang mga halaga ng ELISA ay ginagamit upang suportahan ang diagnostic na pag-uuri ng mga paksa batay sa itinatag na AD biomarker cut-off na pamantayan (66, 67). Ang pangunahing data ng demograpiko at diagnostic para sa iba pang mga pagsusuri sa CSF (FTD, ALS, at PD) ay nakukuha rin mula sa Emory ADRC o mga kaakibat na institusyong pananaliksik. Ang metadata ng buod ng kaso para sa mga kaso ng Emory CSF na ito ay matatagpuan sa Talahanayan S1A. Ang mga katangian ng Swiss CSF replication 3 cohort ay dati nang nai-publish (45).
Natagpuan ng CSF ang sample. Upang madagdagan ang lalim ng aming pagtuklas ng set ng data ng CSF, isinagawa ang immune consumption ng mga high-abundance na protina bago ang trypsinization. Sa madaling salita, 130 μl ng CSF mula sa 40 indibidwal na mga sample ng CSF at isang pantay na dami (130 μl) ng High Select Top14 Abundance Protein Depletion Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372) ay inilagay sa isang spin column (Thermo Fisher Scientific, A89868) sa silid temperatura Incubate). Pagkatapos paikutin ng 15 minuto, i-centrifuge ang sample sa 1000g sa loob ng 2 minuto. Ang isang 3K ultracentrifugal filter device (Millipore, UFC500396) ay ginamit upang i-concentrate ang effluent sample sa pamamagitan ng centrifuging sa 14,000g sa loob ng 30 minuto. Dilute ang lahat ng sample volume sa 75 μl na may phosphate buffered saline. Ang konsentrasyon ng protina ay nasuri ng paraan ng bicinchoninic acid (BCA) ayon sa protocol ng tagagawa (Thermo Fisher Scientific). Ang immunodepleted CSF (60 μl) mula sa lahat ng 40 na mga sample ay hinukay na may lysyl endopeptidase (LysC) at trypsin. Sa madaling sabi, ang sample ay nabawasan at na-alkylated na may 1.2 μl 0.5 M tris-2(-carboxyethyl) -phosphine at 3 μl 0.8 M chloroacetamide sa 90°C sa loob ng 10 minuto, at pagkatapos ay sonicated sa isang paliguan ng tubig sa loob ng 15 minuto. Ang sample ay natunaw ng 193 μl 8 M urea buffer [8 M urea at 100 mM NaHPO4 (pH 8.5)] hanggang sa panghuling konsentrasyon ng 6 M urea. Ang LysC (4.5 μg; Wako) ay ginagamit para sa magdamag na pantunaw sa temperatura ng silid. Ang sample ay pagkatapos ay diluted sa 1 M urea na may 50 mM ammonium bicarbonate (ABC) (68). Magdagdag ng katumbas na halaga (4.5 μg) ng trypsin (Promega), at pagkatapos ay i-incubate ang sample sa loob ng 12 oras. Acidify ang digested peptide solution sa panghuling konsentrasyon ng 1% formic acid (FA) at 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) (66), at pagkatapos ay mag-desalt na may 50 mg Sep-Pak C18 column (Waters) gaya ng inilarawan sa itaas (25) . Ang peptide ay pagkatapos ay na-eluted sa 1 ml ng 50% acetonitrile (ACN). Upang i-standardize ang quantification ng protina sa mga batch (25), pinagsama ang 100 μl aliquots mula sa lahat ng 40 na sample ng CSF upang makabuo ng isang halo-halong sample, na pagkatapos ay nahahati sa limang global internal standard (GIS) (48) na mga sample. Ang lahat ng indibidwal na sample at pinagsamang pamantayan ay pinatuyo ng high-speed vacuum (Labconco).
Kinokopya ng CSF ang sample. Dati nang inilarawan ni Dayon at ng mga kasamahan ang immune depletion at digestion ng CSF copy 3 samples (45, 46). Ang natitirang mga kopyang sample ay hindi indibidwal na immunodepleted. Digest ang mga hindi naalis na sample na ito sa trypsin tulad ng inilarawan dati (17). Para sa bawat paulit-ulit na pagsusuri, 120 μl aliquots ng eluted peptide mula sa bawat sample ay pinagsama-sama at nahahati sa pantay na dami ng aliquots na gagamitin bilang TMT-label na pandaigdigang panloob na pamantayan (48). Ang lahat ng indibidwal na sample at pinagsamang pamantayan ay pinatuyo ng high-speed vacuum (Labconco). Upang mapahusay ang signal ng low-abundance CSF protein, sa pamamagitan ng pagsasama-sama ng 125 μl mula sa bawat sample, isang "pinahusay" na sample ang inihanda para sa bawat replicate analysis [ibig sabihin, isang biological sample na ginagaya ang sample ng pananaliksik, ngunit ang halagang magagamit ay mas malaki (37, 69)] pinagsama sa isang halo-halong sample ng CSF (17). Ang halo-halong sample ay pagkatapos ay immunoremoved gamit ang 12 ml ng High Select Top14 Abundance Protein Removal Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372), na hinukay tulad ng inilarawan sa itaas, at kasama sa kasunod na maraming TMT labeling.
Oras ng post: Ago-27-2021