Salamat sa pagbisita sa Nature.com. Ang bersyon ng browser na iyong ginagamit ay may limitadong suporta sa CSS. Para sa pinakamagandang karanasan, inirerekomenda namin na gumamit ka ng na-update na browser (o huwag paganahin ang Compatibility Mode sa Internet Explorer). Pansamantala, upang matiyak ang patuloy na suporta, ire-render namin ang site nang walang mga istilo at JavaScript.
Ang mga thermophile ay mga mikroorganismo na umuunlad sa mataas na temperatura. Ang pag-aaral sa mga ito ay maaaring magbigay ng mahalagang impormasyon tungkol sa kung paano umaangkop ang buhay sa matinding mga kondisyon. Gayunpaman, mahirap makamit ang mga kondisyon ng mataas na temperatura gamit ang maginoo na optical microscope. Ilang mga solusyong gawa sa bahay batay sa lokal na resistive electrical heating ang iminungkahi, ngunit walang simpleng komersyal na solusyon. Sa papel na ito, ipinakilala namin ang konsepto ng microscale laser heating sa larangan ng view ng mikroskopyo upang magbigay ng mataas na temperatura para sa mga pag-aaral ng thermophile habang pinananatiling banayad ang kapaligiran ng gumagamit. Ang microscale heating sa katamtamang intensity ng laser ay maaaring makamit gamit ang isang gintong nanoparticle coated substrate bilang isang biocompatible at mahusay na light absorber. Ang mga posibleng epekto ng microscale fluid convection, cell retention, at centrifugal thermophoretic motion ay tinatalakay. Ang pamamaraan ay ipinakita sa dalawang species: (i) Geobacillus stearothermophilus, isang aktibong thermophilic bacterium na nagpaparami sa humigit-kumulang 65°C, na aming naobserbahan na tumubo, lumago at lumangoy sa ilalim ng microscale heating; (ii) Thiobacillus sp., isang pinakamainam na hyperthermophilic archaea. sa 80°C. Ang gawaing ito ay nagbibigay daan para sa simple at ligtas na pagmamasid sa mga thermophilic microorganism gamit ang moderno at abot-kayang microscopy tool.
Sa paglipas ng bilyun-bilyong taon, ang buhay sa Earth ay nagbago upang umangkop sa isang malawak na hanay ng mga kondisyon sa kapaligiran na kung minsan ay itinuturing na sukdulan mula sa ating pananaw ng tao. Sa partikular, ang ilang mga thermophilic microorganism (bacteria, archaea, fungi) na tinatawag na thermophile ay umuunlad sa hanay ng temperatura mula 45°C hanggang 122°C1, 2, 3, 4. Ang mga thermophile ay nakatira sa iba't ibang ecosystem, tulad ng deep sea hydrothermal vents, hot springs o mga lugar ng bulkan. Ang kanilang pananaliksik ay nakabuo ng maraming interes sa nakalipas na ilang dekada para sa hindi bababa sa dalawang dahilan. Una, matututo tayo mula sa kanila, halimbawa, kung paano matatag ang mga thermophile 5, 6, enzymes 7, 8 at membranes 9 sa ganoong kataas na temperatura, o kung paano makatiis ang mga thermophile sa matinding antas ng radiation10. Pangalawa, sila ang batayan para sa maraming mahahalagang biotechnological application1,11,12 tulad ng paggawa ng gasolina13,14,15,16, chemical synthesis (dihydro, alcohols, methane, amino acids, atbp.)17, biomining18 at thermostable biocatalysts7 ,11, 13. Sa partikular, ang kasalukuyang kilalang polymerase chain reaction (PCR)19 ay nagsasangkot ng isang enzyme (Taq polymerase) na nakahiwalay sa thermophilic bacterium na Thermus aquaticus, isa sa mga unang thermophile na natuklasan.
Gayunpaman, ang pag-aaral ng mga thermophile ay hindi isang madaling gawain at hindi maaaring improvised sa anumang biological laboratoryo. Sa partikular, ang mga nabubuhay na thermophile ay hindi maaaring obserbahan sa vitro gamit ang anumang karaniwang light microscope, kahit na may mga heating chamber na available sa komersyo, kadalasang na-rate para sa mga temperatura na kasingbaba ng 40°C. Mula noong 1990s, iilan lamang sa mga pangkat ng pananaliksik ang nagtalaga ng kanilang sarili sa pagpapakilala ng mga high-temperature microscopy (HTM) system. Noong 1994 Glukh et al. Ang heating/cooling chamber ay naisip batay sa paggamit ng isang Peltier cell na kumokontrol sa temperatura ng rectangular capillaries na sarado upang mapanatili ang anaerobicity 20 . Maaaring painitin ang device hanggang 100 °C sa bilis na 2 °C/s, na nagpapahintulot sa mga may-akda na pag-aralan ang motility ng hyperthermophilic bacterium na Thermotoga maritima21. Noong 1999 Horn et al. Ang isang katulad na aparato ay binuo, batay pa rin sa paggamit ng pinainit na mga capillary na angkop para sa komersyal na mikroskopya upang pag-aralan ang cell division/koneksyon. Pagkatapos ng mahabang panahon ng kamag-anak na kawalan ng aktibidad, ipinagpatuloy ang paghahanap para sa mga epektibong HTM noong 2012, partikular na kaugnay ng isang serye ng mga papeles ng grupong Wirth na gumamit ng device na naimbento ni Horn et al. Labinlimang taon na ang nakalilipas, ang motility ng isang malaking bilang ng archaea, kabilang ang hyperthermophiles, ay pinag-aralan sa mga temperatura hanggang sa 100 ° C gamit ang pinainit na mga capillary23,24. Binago din nila ang orihinal na mikroskopyo upang makamit ang mas mabilis na pag-init (ilang minuto sa halip na 35 minuto upang maabot ang itinakdang temperatura) at makamit ang isang linear na gradient ng temperatura na higit sa 2 cm sa kabuuan. Ginamit ang temperature gradient shaping device (TGFD) na ito upang pag-aralan ang mobility ng maraming thermophile sa loob ng temperature gradients sa mga biologically relevant na distansya 24, 25 .
Ang pag-init ng mga saradong capillary ay hindi ang tanging paraan upang obserbahan ang mga live na thermophile. Noong 2012, Kuwabara et al. Ginamit ang mga homemade disposable Pyrex chamber na selyadong may heat-resistant adhesive (Super X2; Cemedine, Japan). Ang mga sample ay inilagay sa isang available na komersyal na transparent heating plate (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Japan) na may kakayahang magpainit hanggang 110°C, ngunit hindi orihinal na inilaan para sa bioimaging. Naobserbahan ng mga may-akda ang mahusay na paghahati ng anaerobic thermophilic bacteria (Thermosipho globiformans, oras ng pagdodoble ng 24 min) sa 65°C. Noong 2020, ang Pulshen et al. Ang mahusay na pag-init ng mga komersyal na pagkaing metal (AttofluorTM, Thermofisher) ay ipinakita gamit ang dalawang lutong bahay na elemento ng pag-init: isang takip at isang entablado (PCR machine-inspired configuration). Ang asosasyong ito ay nagreresulta sa isang pare-parehong temperatura ng likido at pinipigilan ang pagsingaw at paghalay sa ilalim ng takip. Ang paggamit ng O-ring ay umiiwas sa palitan ng gas sa kapaligiran. Ang HTM na ito, na tinatawag na Sulfoscope, ay ginamit upang imahen ang Sulfolobus acidocaldarius sa 75°C27.
Ang isang kinikilalang limitasyon ng lahat ng mga sistemang ito ay ang paghihigpit sa paggamit ng mga layunin ng hangin, anumang oil immersion ay hindi angkop para sa ganoong mataas na temperatura at para sa imaging sa pamamagitan ng >1-mm na makapal na transparent na mga sample. Ang isang kinikilalang limitasyon ng lahat ng mga sistemang ito ay ang paghihigpit sa paggamit ng mga layunin ng hangin, anumang oil immersion ay hindi angkop para sa ganoong mataas na temperatura at para sa imaging sa pamamagitan ng >1-mm na makapal na transparent na mga sample. Общепризнанным недостатком всех этих систем было ограничение на использование воздушных объективов, посколимкужов ение в масло не подходило для такой высокой температуры и для визуализации через прозрачные образцы толщ1инмой. Ang isang kinikilalang pagkukulang ng lahat ng mga sistemang ito ay ang limitasyon sa paggamit ng mga layunin ng hangin, dahil ang anumang paglulubog ng langis ay hindi angkop para sa gayong mataas na temperatura at para sa visualization sa pamamagitan ng mga transparent na sample na may kapal na 1 mm.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不适合这样的1合高样的1合高样厚的透明样品成像。 Ang isang kinikilalang limitasyon ng lahat ng mga sistemang ito ay ang limitasyon ng paggamit ng isang naka-air-entrained mirror, dahil ang anumang oil immersion ay hindi angkop para sa pag-imaging ng mga transparent na sample na>1 mm ang kapal sa ganoong mataas na temperatura. Общепризнанным недостатком всех этих систем является ограниченное использование воздушных объективов, лимубово масло непригодно для таких высоких температур и визуализации через прозрачные образцы толщиной >1 мм. Ang isang kinikilalang disbentaha ng lahat ng mga sistemang ito ay ang limitadong paggamit ng mga air lens, anumang oil immersion ay hindi angkop para sa ganoong mataas na temperatura at visualization sa pamamagitan ng mga transparent na sample na >1 mm ang kapal.Kamakailan lamang, ang limitasyong ito ay inalis ni Charles-Orzag et al. 28, na bumuo ng isang aparato na hindi na nagbibigay ng init sa paligid ng sistema ng interes, ngunit sa halip sa loob mismo ng takip na salamin, na natatakpan ng isang manipis na transparent na layer ng isang risistor na gawa sa ITO (indium-tin oxide). Ang takip ay maaaring magpainit hanggang sa 75 °C sa pamamagitan ng pagpasa ng electric current sa transparent na layer. Gayunpaman, dapat ding painitin ng may-akda ang lens sa layunin, ngunit hindi hihigit sa 65 °C, upang hindi ito masira.
Ang mga gawang ito ay nagpapakita na ang pag-unlad ng mahusay na mataas na temperatura na optical microscopy ay hindi malawakang pinagtibay, kadalasang nangangailangan ng mga kagamitang gawang bahay, at kadalasang nakakamit sa halaga ng spatial resolution, na isang malubhang kawalan dahil ang mga thermophilic microorganism ay hindi mas malaki kaysa sa iilan. micrometers. Ang pagbabawas ng volume ng pag-init ay ang susi sa paglutas ng tatlong likas na problema ng HTM: mahinang spatial resolution, mataas na thermal inertia kapag uminit ang system, at nakakapinsalang pag-init ng mga elemento sa paligid (immersion oil, objective lens... o mga kamay ng user) sa matinding temperatura. ).
Sa papel na ito, ipinakilala namin ang isang HTM para sa pagmamasid sa thermophile na hindi batay sa resistive heating. Sa halip, nakamit namin ang naisalokal na pag-init sa loob ng isang limitadong rehiyon ng larangan ng pagtingin ng mikroskopyo sa pamamagitan ng pag-iilaw ng laser ng isang substrate na sumisipsip ng liwanag. Ang pamamahagi ng temperatura ay na-visualize gamit ang quantitative phase microscopy (QPM). Ang pagiging epektibo ng pamamaraang ito ay ipinakita ng Geobacillus stearothermophilus, isang motile thermophilic bacterium na nagpaparami sa humigit-kumulang 65°C at may maikling oras ng pagdodoble (mga 20 minuto), at Sulfolobus shibatae, isang hyperthermophile na mahusay na lumalaki sa 80°C (archaea) upang ilarawan. Ang normal na rate ng pagtitiklop at paglangoy ay naobserbahan bilang isang function ng temperatura. Ang laser HTM (LA-HTM) na ito ay hindi limitado sa kapal ng coverslip o sa likas na katangian ng layunin (air o oil immersion). Nagbibigay-daan ito sa anumang high resolution na lens sa merkado na magamit. Hindi rin ito dumaranas ng mabagal na pag-init dahil sa thermal inertia (nakakamit ng instant heating sa millisecond scale) at gumagamit lamang ng mga bahaging magagamit sa komersyo. Ang tanging bagong alalahanin sa kaligtasan ay nauugnay sa pagkakaroon ng malalakas na laser beam (karaniwang hanggang 100 mW) sa loob ng device at posibleng sa pamamagitan ng mga mata, na nangangailangan ng protective goggles.
Ang prinsipyo ng LA-HTM ay ang paggamit ng laser para initin ang sample nang lokal sa loob ng field of view ng mikroskopyo (Fig. 1a). Upang gawin ito, ang sample ay dapat na liwanag na sumisipsip. Upang gumamit ng isang makatwirang kapangyarihan ng laser (mas mababa sa 100 mW), hindi kami umasa sa pagsipsip ng liwanag ng likidong daluyan, ngunit artipisyal na nadagdagan ang pagsipsip ng sample sa pamamagitan ng patong sa substrate na may gintong nanoparticle (Fig. 1c). Ang pag-init ng mga gintong nanoparticle na may liwanag ay may pangunahing kahalagahan sa larangan ng thermal plasmonics, na may inaasahang aplikasyon sa biomedicine, nanochemistry o pag-ani ng sikat ng araw29,30,31. Sa nakalipas na ilang taon, ginamit namin ang LA-HTM na ito sa ilang pag-aaral na nauugnay sa mga aplikasyon ng thermal plasma sa pisika, kimika at biology. Ang pangunahing kahirapan sa pamamaraang ito ay sa pagpapakita ng panghuling profile ng temperatura, dahil ang nakataas na temperatura ay limitado sa isang microscale na rehiyon sa loob ng sample. Ipinakita namin na ang pagmamapa ng temperatura ay maaaring makamit gamit ang four-wavelength na transverse shear interferometer, isang simple, mataas na resolution, at napakasensitibong paraan ng quantitative phase microscopy batay sa paggamit ng two-dimensional diffraction gratings (kilala rin bilang cross gratings) 33,34,35,36. Ang pagiging maaasahan ng thermal microscopy technique na ito, batay sa crossed grating wavefront microscopy (CGM), ay naipakita sa isang dosenang papel na inilathala sa nakalipas na dekada37,38,39,40,41,42,43.
Scheme ng pag-install ng parallel laser heating, shaping at temperature microscope. b Sample geometry na binubuo ng isang AttofluorTM chamber na naglalaman ng coverslip na pinahiran ng gold nanoparticle. c Tingnang mabuti ang sample (hindi sa sukat). d ay kumakatawan sa pare-parehong laser beam profile at (e) ang simulate na kasunod na pamamahagi ng temperatura sa sample plane ng gold nanoparticle. f ay isang annular laser beam profile na angkop para sa pagbuo ng isang pare-parehong temperatura tulad ng ipinapakita sa simulation ng resultang pamamahagi ng temperatura na ipinapakita sa (g). Scale bar: 30 µm.
Sa partikular, kamakailan lamang ay nakamit namin ang pag-init ng mga mammalian cells na may LA-HTM at CGM at sinusubaybayan ang mga tugon ng cellular heat shock sa hanay na 37-42 ° C, na nagpapakita ng pagiging angkop ng diskarteng ito sa solong living cell imaging. Gayunpaman, ang aplikasyon ng LA-HTM sa pag-aaral ng mga mikroorganismo sa mataas na temperatura ay hindi malabo, dahil nangangailangan ito ng higit na pag-iingat kumpara sa mga selulang mammalian: una, ang pag-init sa ilalim ng daluyan ng sampu-sampung degree (sa halip na ilang degree) ay humahantong. sa isang malakas na vertical na gradient ng temperatura. ay maaaring lumikha ng tuluy-tuloy na convection 44 na, kung hindi mahigpit na nakakabit sa substrate, ay maaaring maging sanhi ng hindi kanais-nais na paggalaw at paghahalo ng bakterya. Ang kombeksyon na ito ay maaaring alisin sa pamamagitan ng pagbabawas ng kapal ng likidong layer. Para sa layuning ito, sa lahat ng mga eksperimento na ipinakita sa ibaba, ang mga bacterial suspension ay inilagay sa pagitan ng dalawang coverslip na humigit-kumulang 15 µm ang kapal na inilagay sa loob ng isang metal na tasa (AttofluorTM, Thermofisher, Fig. 1b,c). Sa prinsipyo, maiiwasan ang convection kung ang kapal ng likido ay mas maliit kaysa sa laki ng beam ng heating laser. Pangalawa, ang pagtatrabaho sa isang limitadong geometry ay maaaring maka-suffocate ng mga aerobic na organismo (tingnan ang Fig. S2). Maiiwasan ang problemang ito sa pamamagitan ng paggamit ng substrate na permeable sa oxygen (o anumang iba pang mahahalagang gas), sa pamamagitan ng pag-iiwan ng mga nakakulong na bula ng hangin sa loob ng coverslip, o sa pamamagitan ng pagbabarena ng mga butas sa tuktok na coverslip (tingnan ang Fig. S1) 45 . Sa pag-aaral na ito, pinili namin ang huling solusyon (Mga Figure 1b at S1). Sa wakas, ang laser heating ay hindi nagbibigay ng pare-parehong pamamahagi ng temperatura. Kahit na sa parehong intensity ng laser beam (Larawan 1d), ang pamamahagi ng temperatura ay hindi pare-pareho, ngunit sa halip ay kahawig ng pamamahagi ng Gaussian dahil sa thermal diffusion (Fig. 1e). Kapag ang layunin ay magtatag ng mga tumpak na temperatura sa larangan ng pagtingin para sa pag-aaral ng mga biological system, ang hindi pantay na mga profile ay hindi perpekto at maaari ring humantong sa thermophoretic na paggalaw ng bakterya kung hindi sila sumunod sa substrate (tingnan ang Fig. S3, S4)39. Sa layuning ito, gumamit kami ng spatial light modulator (SLM) upang hubugin ang infrared laser beam ayon sa hugis ng singsing (Fig. 1f) sa eroplano ng sample upang makamit ang perpektong pare-parehong pamamahagi ng temperatura sa loob ng isang ibinigay na geometric na lugar, sa kabila ng thermal diffusion (Fig. 1d) 39 , 42, 46. Maglagay ng top coverslip sa ibabaw ng metal dish (Figure 1b) upang maiwasan ang pagsingaw ng medium at obserbahan nang hindi bababa sa ilang araw. Dahil ang top coverslip na ito ay hindi selyado, ang karagdagang medium ay madaling maidagdag anumang oras kung kinakailangan.
Upang ilarawan kung paano gumagana ang LA-HTM at ipakita ang pagiging angkop nito sa thermophilic na pananaliksik, pinag-aralan namin ang aerobic bacteria na Geobacillus stearothermophilus, na may pinakamainam na temperatura ng paglago na humigit-kumulang 60-65°C. Ang bacterium ay mayroon ding flagella at ang kakayahang lumangoy, na nagbibigay ng isa pang tagapagpahiwatig ng normal na aktibidad ng cellular.
Ang mga sample (Larawan 1b) ay pre-incubated sa 60°C sa loob ng isang oras at pagkatapos ay inilagay sa isang LA-HTM sample holder. Ang pre-incubation na ito ay opsyonal, ngunit kapaki-pakinabang pa rin, para sa dalawang dahilan: Una, kapag ang laser ay naka-on, nagiging sanhi ito ng paglaki at paghati-hati ng mga cell (tingnan ang pelikulang M1 sa Mga Pandagdag na Materyal). Nang walang pre-incubation, ang paglaki ng bacterial ay karaniwang naaantala ng humigit-kumulang 40 minuto sa bawat oras na ang isang bagong viewing area ay pinainit sa sample. Pangalawa, ang 1 oras na pre-incubation ay nag-promote ng pagdirikit ng bakterya sa coverslip, na pinipigilan ang mga cell mula sa pag-anod sa labas ng larangan ng view dahil sa thermophoresis kapag ang laser ay naka-on (tingnan ang film M2 sa Mga Pandagdag na Materyal). Ang Thermophoresis ay ang paggalaw ng mga particle o molekula kasama ang gradient ng temperatura, kadalasan mula sa mainit hanggang sa malamig, at ang bacteria ay walang exception43,47. Ang hindi kanais-nais na epekto na ito ay inalis sa isang partikular na lugar sa pamamagitan ng paggamit ng SLM upang hubugin ang laser beam at makamit ang isang patag na pamamahagi ng temperatura.
Sa fig. Ipinapakita ng Figure 2 ang pamamahagi ng temperatura na sinusukat ng CGM na nakuha sa pamamagitan ng pag-iilaw ng isang glass substrate na pinahiran ng mga gintong nanoparticle na may isang annular laser beam (Fig. 1f). Ang isang patag na pamamahagi ng temperatura ay naobserbahan sa buong lugar na sakop ng laser beam. Itinakda ang zone na ito sa 65°C, ang pinakamainam na temperatura ng paglago. Sa labas ng rehiyong ito, natural na bumababa ang curve ng temperatura sa \(1/r\) (kung saan ang \(r\) ay ang radial coordinate).
isang Temperatura na mapa ng mga sukat ng CGM na nakuha sa pamamagitan ng paggamit ng isang annular laser beam upang i-irradiate ang isang layer ng gold nanoparticle upang makakuha ng flat temperature profile sa isang bilog na lugar. b Isotherm ng mapa ng temperatura (a). Ang tabas ng laser beam ay kinakatawan ng isang kulay abong tuldok na bilog. Ang eksperimento ay naulit nang dalawang beses (tingnan ang Mga Pandagdag na Materyal, Larawan S4).
Ang posibilidad ng mga bacterial cell ay sinusubaybayan ng maraming oras gamit ang LA-HTM. Sa fig. Ipinapakita ng 3 ang agwat ng oras para sa apat na larawang kinunan mula sa isang 3 oras 20 minutong pelikula (Pelikula M3, Karagdagang Impormasyon). Ang mga bakterya ay naobserbahang aktibong dumami sa loob ng pabilog na lugar na tinukoy ng laser kung saan ang temperatura ay pinakamainam, na papalapit sa 65°C. Sa kaibahan, ang paglaki ng cell ay makabuluhang nabawasan kapag bumaba ang temperatura sa ibaba 50°C sa loob ng 10 s.
Optical depth na mga larawan ng G. stearothermophilus bacteria na lumalaki pagkatapos ng laser heating sa iba't ibang oras, (a) t = 0 min, (b) 1 h 10 min, (c) 2 h 20 min, (d) 3 h 20 min, out of 200 Kinuha mula sa isang minutong pelikula (M3 film na ibinigay sa Karagdagang Impormasyon) na nakapatong sa kaukulang mapa ng temperatura. Ang laser ay lumiliko sa oras \(t=0\). Idinagdag ang mga isotherm sa imahe ng intensity.
Upang higit pang matukoy ang paglaki ng cell at ang pag-asa nito sa temperatura, sinukat namin ang pagtaas ng biomass ng iba't ibang kolonya ng mga unang nakahiwalay na bakterya sa larangan ng view ng Movie M3 (Fig. 4). Ang parent bacteria na napili sa simula ng pagbuo ng mini colony forming unit (mCFU) ay ipinapakita sa Figure S6. Ang mga dry mass measurements ay kinuha gamit ang isang CGM 48 camera na ginamit upang i-map ang distribusyon ng temperatura. Ang kakayahan ng CGM na sukatin ang tuyong timbang at temperatura ay ang lakas ng LA-HTM. Gaya ng inaasahan, ang mataas na temperatura ay nagdulot ng mas mabilis na paglaki ng bacteria (Larawan 4a). Gaya ng ipinapakita sa semi-log plot sa Fig. 4b, ang paglago sa lahat ng temperatura ay sumusunod sa exponential growth, kung saan ginagamit ng data ang exponential function na \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ {{ \mbox{cst}}}\), kung saan \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}}2\) – oras ng henerasyon (o oras ng pagdodoble), \( g =1/ \tau\) – rate ng paglago (bilang ng mga dibisyon bawat yunit ng oras ). Sa fig. Ipinapakita ng 4c ang kaukulang rate ng paglago at oras ng henerasyon bilang isang function ng temperatura. Ang mga mabilis na lumalagong mCFU ay nailalarawan sa pamamagitan ng saturation ng paglago pagkatapos ng dalawang oras, isang inaasahang pag-uugali dahil sa mataas na density ng bakterya (katulad ng nakatigil na yugto sa mga klasikong likidong kultura). Ang pangkalahatang hugis \(g\left(T\right)\) (Fig. 4c) ay tumutugma sa inaasahang two-phase curve para sa G. stearothermophilus na may pinakamainam na rate ng paglago sa paligid ng 60-65°C. Itugma ang data gamit ang isang kardinal na modelo (Figure S5)49 kung saan \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0.70 ± 0.2; 40 ± 4; 65 ± 1.6; 67 ± 3) °C, na sumasang-ayon nang husto sa iba pang mga halagang binanggit sa literatura49. Bagama't ang mga parameter na umaasa sa temperatura ay maaaring kopyahin, ang maximum na rate ng paglago ng \({G}_{0}\) ay maaaring mag-iba mula sa isang eksperimento patungo sa isa pa (tingnan ang mga figure S7-S9 at pelikula M4). Sa kaibahan sa mga parameter na angkop sa temperatura, na dapat ay unibersal, ang pinakamataas na rate ng paglago ay nakasalalay sa mga katangian ng medium (availability ng nutrients, oxygen concentration) sa loob ng naobserbahang microscale geometry.
isang paglago ng mikrobyo sa iba't ibang temperatura. mCFU: Miniature Colony Forming Units. Nakuha ang data mula sa isang video ng iisang bacterium na lumalaki sa gradient ng temperatura (pelikula M3). b Kapareho ng (a), semi-logarithmic scale. c Growth rate\(\tau\) at generation time\(g\) na kinakalkula mula sa linear regression (b). Mga pahalang na error bar: hanay ng temperatura kung saan lumawak ang mga mCFU sa larangan ng pagtingin sa panahon ng paglaki. Vertical error bars: linear regression standard error.
Bilang karagdagan sa normal na paglaki, kung minsan ay lumulutang ang ilang bakterya sa panahon ng pag-init ng laser, na isang inaasahang pag-uugali para sa bakterya na may flagella. Ang pelikulang M5 sa karagdagang impormasyon ay nagpapakita ng mga naturang aktibidad sa paglangoy. Sa eksperimentong ito, ginamit ang unipormeng laser radiation upang lumikha ng gradient ng temperatura, tulad ng ipinapakita sa Mga Figure 1d, e at S3. Ang Figure 5 ay nagpapakita ng dalawang pagkakasunud-sunod ng imahe na pinili mula sa M5 na pelikula na nagpapakita na ang isang bacterium ay nagpapakita ng direksyon ng paggalaw habang ang lahat ng iba pang bakterya ay nananatiling hindi gumagalaw.
Ang dalawang time frame (a) at (b) ay nagpapakita ng paglangoy ng dalawang magkaibang bacteria na minarkahan ng mga tuldok na bilog. Ang mga larawan ay kinuha mula sa M5 na pelikula (ibinigay bilang pandagdag na materyal).
Sa kaso ng G. stearothermophilus, ang aktibong paggalaw ng bakterya (Larawan 5) ay nagsimula ng ilang segundo pagkatapos i-on ang laser beam. Ang pagmamasid na ito ay binibigyang-diin ang temporal na tugon ng thermophilic microorganism na ito sa pagtaas ng temperatura, gaya ng naobserbahan na ni Mora et al. 24 . Ang paksa ng bacterial motility at maging ang thermotaxis ay maaaring higit pang tuklasin gamit ang LA-HTM.
Ang paglangoy ng mikrobyo ay hindi dapat malito sa iba pang mga uri ng pisikal na paggalaw, katulad ng (i) Brownian motion, na tila magulong paggalaw na walang tiyak na direksyon, (ii) convection 50 at thermophoresis 43, na binubuo ng isang regular na drift ng paggalaw sa isang temperatura gradient.
Ang G. stearothermophilus ay kilala sa kakayahang gumawa ng mataas na lumalaban na spores (spore formation) kapag nalantad sa masamang kondisyon sa kapaligiran bilang isang depensa. Kapag ang mga kondisyon sa kapaligiran ay naging paborable muli, ang mga spores ay tumutubo, na bumubuo ng mga buhay na selula at nagpapatuloy sa paglaki. Bagama't kilala ang proseso ng sporulation/germination na ito, hindi pa ito naobserbahan sa real time. Gamit ang LA-HTM, iniuulat namin dito ang unang obserbasyon ng mga kaganapan sa pagtubo sa G. stearothermophilus.
Sa fig. Ang 6a ay nagpapakita ng mga time-lapse na imahe ng optical depth (OT) na nakuha gamit ang isang CGM set ng 13 spores. Para sa buong oras ng pagkolekta (15 h 6 min, \(t=0\) – simula ng laser heating), 4 sa 13 spores ang tumubo, sa sunud-sunod na time point \(t=2\) h, \( 3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' at \(11\) h \(30\)'. Bagaman isa lamang sa mga kaganapang ito ang ipinapakita sa Figure 6, 4 na mga kaganapan sa pagtubo ang maaaring maobserbahan sa M6 movie sa pandagdag na materyal. Kapansin-pansin, lumilitaw na random ang pagtubo: hindi lahat ng spores ay tumutubo at hindi tumutubo nang sabay-sabay, sa kabila ng parehong mga pagbabago sa mga kondisyon sa kapaligiran.
isang Time-lapse na binubuo ng 8 OT na imahe (oil immersion, 60x, 1.25 NA layunin) at (b) biomass evolution ng G. stearothermophilus aggregates. c (b) Iginuhit sa isang semi-log scale upang i-highlight ang linearity ng growth rate (dashed line).
Sa fig. Ipinapakita ng 6b, c ang biomass ng mga populasyon ng cell sa larangan ng view bilang isang function ng oras sa buong panahon ng pagkolekta ng data. Ang mabilis na pagkabulok ng tuyong masa na naobserbahan sa \(t=5\)h sa fig. 6b, c, dahil sa paglabas ng ilang mga cell mula sa larangan ng view. Ang rate ng paglago ng apat na kaganapang ito ay \(0.77\pm 0.1\) h-1. Ang halagang ito ay mas mataas kaysa sa rate ng paglago na nauugnay sa Figure 3. 3 at 4, kung saan normal na lumalaki ang mga cell. Ang dahilan para sa pagtaas ng rate ng paglago ng G. stearothermophilus mula sa mga spores ay hindi malinaw, ngunit ang mga sukat na ito ay nagpapakita ng interes ng LA-HTM at gumagana sa solong antas ng cell (o sa isang antas ng mCFU) upang matuto nang higit pa tungkol sa dinamika ng buhay ng cell. .
Upang higit pang ipakita ang versatility ng LA-HTM at ang pagganap nito sa mataas na temperatura, sinuri namin ang paglaki ng Sulfolobus shibatae, isang hyperthermophilic acidophilic archaea na may pinakamabuting kalagayan na temperatura ng paglago na 80°C51. Kung ikukumpara sa G. stearothermophilus, ang mga archaea na ito ay mayroon ding ibang-ibang morpolohiya, na kahawig ng 1 micron spheres (cocci) kaysa sa mga pahabang rod (bacilli).
Ang Figure 7a ay binubuo ng mga sunud-sunod na optical depth na imahe ng S. shibatae mCFU na nakuha gamit ang CGM (tingnan ang M7 feature film sa Mga Pandagdag na Materyal). Ang mCFU na ito ay lumalaki sa humigit-kumulang 73°C, mas mababa sa pinakamainam na temperatura na 80°C, ngunit nasa loob ng hanay ng temperatura para sa aktibong paglaki. Naobserbahan namin ang maramihang mga kaganapan sa fission na nagmukhang mga microgrape ng archaea ang mga mCFU pagkatapos ng ilang oras. Mula sa mga imaheng OT na ito, ang mCFU biomass ay sinusukat sa paglipas ng panahon at ipinakita sa Figure 7b. Kapansin-pansin, ang S. shibatae mCFUs ay nagpakita ng linear na paglago kaysa sa exponential growth na nakikita sa G. stearothermophilus mCFUs. Nagkaroon ng matagal na talakayan 52 tungkol sa likas na katangian ng mga rate ng paglaki ng cell: habang ang ilang mga pag-aaral ay nag-uulat ng mga rate ng paglago ng mga mikrobyo na proporsyonal sa kanilang laki (exponential growth), ang iba ay nagpapakita ng patuloy na rate (linear o bilinear na paglaki). Tulad ng ipinaliwanag ni Tzur et al.53, ang pagkilala sa pagitan ng exponential at (bi)linear na paglago ay nangangailangan ng katumpakan na <6% sa mga pagsukat ng biomass, na hindi maabot ng karamihan sa mga diskarte ng QPM, kahit na kinasasangkutan ng interferometry. Tulad ng ipinaliwanag ni Tzur et al.53, ang pagkilala sa pagitan ng exponential at (bi)linear na paglago ay nangangailangan ng katumpakan na <6% sa mga pagsukat ng biomass, na hindi maabot ng karamihan sa mga diskarte ng QPM, kahit na kinasasangkutan ng interferometry. Как объяснили Цур и др.53, различение экспоненциального и (би)линейного роста требует точности <6% в избеиостих для большинства методов QPM, даже с использованием интерферометрии. Tulad ng ipinaliwanag ni Zur et al.53, ang pagkilala sa pagitan ng exponential at (bi)linear na paglago ay nangangailangan ng <6% na katumpakan sa mga pagsukat ng biomass, na hindi matamo para sa karamihan ng mga pamamaraan ng QPM, kahit na gamit ang interferometry.Tulad ng ipinaliwanag ni Zur et al. 53, ang pagkilala sa pagitan ng exponential at (bi)linear na paglago ay nangangailangan ng mas mababa sa 6% na katumpakan sa mga pagsukat ng biomass, na hindi matamo para sa karamihan ng mga pamamaraan ng QPM, kahit na ginagamit ang interferometry. Nakamit ng CGM ang katumpakan na ito sa katumpakan ng sub-pg sa mga sukat ng biomass36,48.
isang Time-lapse na binubuo ng 6 na OT na imahe (oil immersion, 60x, NA layunin 1.25) at (b) micro-CFU biomass evolution na sinusukat gamit ang CGM. Tingnan ang pelikulang M7 para sa higit pang impormasyon.
Ang perpektong linear na paglaki ng S. shibatae ay hindi inaasahan at hindi pa naiulat. Gayunpaman, inaasahan ang exponential growth, hindi bababa sa dahil sa paglipas ng panahon, dapat mangyari ang maraming dibisyon ng 2, 4, 8, 16 … mga cell. Na-hypothesize namin na ang linear growth ay maaaring dahil sa cell inhibition dahil sa siksik na cell packing, kung paanong bumabagal ang paglaki ng cell at kalaunan ay umabot sa dormant state kapag masyadong mataas ang density ng cell.
Nagtatapos kami sa pamamagitan ng pagtalakay sa sumusunod na limang punto ng interes sa turn: pagbawas sa dami ng pag-init, pagbawas sa thermal inertia, interes sa mga nanoparticle ng ginto, interes sa quantitative phase microscopy, at isang posibleng hanay ng temperatura kung saan maaaring gamitin ang LA-HTM.
Kung ikukumpara sa resistive heating, ang laser heating na ginagamit para sa pagpapaunlad ng HTM ay nag-aalok ng ilang mga pakinabang, na inilalarawan namin sa pag-aaral na ito. Sa partikular, sa likidong media sa larangan ng view ng mikroskopyo, ang dami ng pag-init ay pinananatili sa loob ng ilang (10 μm) 3 volume. Sa ganitong paraan, ang mga naobserbahang mikrobyo lamang ang aktibo, habang ang ibang bakterya ay natutulog at maaaring magamit upang higit pang pag-aralan ang sample - hindi na kailangang baguhin ang sample sa tuwing kailangang suriin ang isang bagong temperatura. Bilang karagdagan, ang microscale heating ay nagbibigay-daan sa direktang pagsusuri ng isang malaking hanay ng mga temperatura: Ang Figure 4c ay nakuha mula sa isang 3-oras na pelikula (Movie M3), na karaniwang nangangailangan ng paghahanda at pagsusuri ng ilang mga sample - isa para sa bawat isa sa mga sample na pinag-aaralan. y ay ang temperatura na kumakatawan sa bilang ng mga araw sa eksperimento. Ang pagbabawas ng pinainit na volume ay nagpapanatili din ng lahat ng nakapalibot na optical na bahagi ng mikroskopyo, lalo na ang object lens, sa temperatura ng silid, na naging isang malaking problema na kinakaharap ng komunidad sa ngayon. Maaaring gamitin ang LA-HTM sa anumang lens, kabilang ang mga oil immersion lens, at mananatili sa temperatura ng kuwarto kahit na may matinding temperatura sa field of view. Ang pangunahing limitasyon ng pamamaraan ng pag-init ng laser na iniulat namin sa pag-aaral na ito ay ang mga cell na hindi nakadikit o lumulutang ay maaaring malayo sa larangan ng pagtingin at mahirap pag-aralan. Ang isang solusyon ay maaaring gumamit ng mababang magnification lens upang makamit ang mas malaking pagtaas ng temperatura na lampas sa ilang daang microns. Ang pag-iingat na ito ay sinamahan ng pagbawas sa spatial resolution, ngunit kung ang layunin ay pag-aralan ang paggalaw ng mga microorganism, hindi kinakailangan ang mataas na spatial resolution.
Ang sukat ng oras para sa pagpainit (at paglamig) ng system \({{{{{\rm{\tau }}}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) ay depende sa laki nito , ayon sa batas \({{{({\rm{\tau }}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), kung saan \ (L\ ) ay ang katangiang laki ng pinagmumulan ng init (ang diameter ng laser beam sa aming pag-aaral ay \(L\ mga 100\) μm), \(D\) ay ang thermal diffusivity ng kapaligiran (average sa aming case, glass at water Diffusion rate\(D\ about 2\fold {10}^{-7}\) m2/s. Samakatuwid, sa pag-aaral na ito, ang mga time response ng pagkakasunod-sunod na 50 ms, ibig sabihin, quasi-instantaneous). Ang mga pagbabago sa temperatura, ay maaaring asahan, ang agarang pagtatatag ng pagtaas ng temperatura ay hindi lamang nagpapaikli sa tagal ng eksperimento, ngunit nagbibigay-daan din sa tumpak na timing \(t=0\) para sa anumang dinamikong pag-aaral ng mga epekto sa temperatura.
Ang aming iminungkahing pamamaraan ay naaangkop sa anumang substrate na sumisipsip ng liwanag (halimbawa, mga komersyal na sample na may ITO coating). Gayunpaman, ang mga nanoparticle ng ginto ay nakakapagbigay ng mataas na pagsipsip sa infrared at mababang pagsipsip sa nakikitang hanay, ang mga huling katangian na kung saan ay interesado para sa epektibong optical observation sa nakikitang hanay, lalo na kapag gumagamit ng fluorescence. Bilang karagdagan, ang ginto ay biocompatible, chemically inert, optical density ay maaaring iakma mula 530 nm hanggang malapit sa infrared, at ang paghahanda ng sample ay simple at matipid29.
Ang transverse grating wavefront microscopy (CGM) ay nagbibigay-daan hindi lamang sa pagmamapa ng temperatura sa microscale, kundi pati na rin sa pagsubaybay sa biomass, na ginagawa itong partikular na kapaki-pakinabang (kung hindi kinakailangan) kasama ng LA-HTM. Sa nakalipas na dekada, ang iba pang mga diskarte sa mikroskopya ng temperatura ay binuo, lalo na sa larangan ng bioimaging, at karamihan sa mga ito ay nangangailangan ng paggamit ng mga fluorescent probes na sensitibo sa temperatura54,55. Gayunpaman, ang mga pamamaraang ito ay pinuna at sinukat ng ilang ulat ang hindi makatotohanang mga pagbabago sa temperatura sa loob ng mga cell, posibleng dahil sa katotohanan na ang fluorescence ay nakasalalay sa maraming mga kadahilanan maliban sa temperatura. Bilang karagdagan, ang karamihan sa mga fluorescent probe ay hindi matatag sa mataas na temperatura. Samakatuwid, ang QPM at sa partikular na CGM ay kumakatawan sa isang perpektong pamamaraan ng mikroskopya ng temperatura para sa pag-aaral ng buhay sa mataas na temperatura gamit ang optical microscopy.
Ang mga pag-aaral ng S. shibatae, na nabubuhay nang husto sa 80°C, ay nagpapakita na ang LA-HTM ay maaaring ilapat sa pag-aaral ng mga hyperthermophile, hindi lamang ng mga simpleng thermophile. Sa prinsipyo, walang limitasyon sa hanay ng mga temperatura na maaaring maabot gamit ang LA-HTM, at kahit na ang mga temperatura sa itaas 100°C ay maaaring maabot sa presyon ng atmospera nang hindi kumukulo, tulad ng ipinakita ng aming pangkat ng 38 sa mga aplikasyon ng hydrothermal chemistry sa atmospera. presyon A. Ang isang laser ay ginagamit para sa pagpainit ng gintong nanoparticle 40 sa parehong paraan. Kaya, ang LA-HTM ay may potensyal na magamit upang obserbahan ang mga walang uliran na hyperthermophile na may karaniwang mataas na resolution na optical microscopy sa ilalim ng karaniwang mga kondisyon (ibig sabihin, sa ilalim ng stress sa kapaligiran).
Ang lahat ng mga eksperimento ay isinagawa gamit ang isang homemade microscope, kabilang ang Köhler illumination (na may LED, M625L3, Thorlabs, 700 mW), specimen holder na may manu-manong xy movement, mga layunin (Olympus, 60x, 0.7 NA, air, LUCPlanFLN60X o 60x, 1.25 NA, Oil , UPLFLN60XOI), CGM camera (QLSI cross grating, 39 µm pitch, 0.87 mm mula sa Andor Zyla camera sensor) para magbigay ng intensity at wavefront imaging, at sCMOS camera (ORCA Flash 4.0 V3, 16-bit mode , mula sa Hamamatsu) para i-record ang data na ipinapakita sa Figure 5 (bacterial swimming). Ang dichroic beam splitter ay isang 749 nm BrightLine edge (Semrock, FF749-SDi01). Ang filter sa harap ng camera ay isang 694 short pass filter (FF02-694/SP-25, Semrock). Titanium sapphire laser (Laser Verdi G10, 532 nm, 10 W, pumped tsunami laser cavity, Spectra-Physics sa Fig. 2-5, na pinalitan pa ng Millenia laser, Spectraphysics 10 W, pumped Mira laser cavity, Coherent, para sa Fig. 2 -5). 6 at 7) ay nakatakda sa wavelength \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) nm, na tumutugma sa plasmon resonance spectrum ng gold nanoparticles. Spatial light modulators (1920 × 1152 pixels) ay binili mula sa Meadowlark Optics Ang mga hologram ay kinakalkula gamit ang Gerchberg-Saxton algorithm tulad ng inilarawan sa link.
Ang cross grating wavefront microscopy (CGM) ay isang optical microscopy technique batay sa pagsasama-sama ng two-dimensional diffraction grating (kilala rin bilang cross grating) sa layo na isang millimeter mula sa isang conventional camera's sensor. Ang pinakakaraniwang halimbawa ng CGM na ginamit namin sa pag-aaral na ito ay tinatawag na four-wavelength transverse shift interferometer (QLSI), kung saan ang cross-grating ay binubuo ng intensity/phase checkerboard pattern na ipinakilala at na-patent ni Primot et al. noong 200034. Ang patayo at pahalang na mga linya ng grating ay lumilikha ng mga anino na parang grid sa sensor, ang pagbaluktot nito ay maaaring iproseso sa real time upang makuha ang optical wavefront distortion (o katumbas na phase profile) ng liwanag ng insidente. Kapag ginamit sa isang mikroskopyo, maaaring ipakita ng isang CGM camera ang pagkakaiba sa optical path ng isang nakalarawang bagay, na kilala rin bilang optical depth (OT), na may sensitivity sa pagkakasunud-sunod ng mga nanometer36. Sa anumang pagsukat ng CGM, upang maalis ang anumang mga depekto sa mga optical na bahagi o beam, isang pangunahing reference na OT na imahe ang dapat kunin at ibawas mula sa anumang kasunod na mga larawan.
Ang temperatura mikroskopya ay isinagawa gamit ang isang CGM camera tulad ng inilarawan sa sanggunian. 32. Sa madaling salita, binabago ng pag-init ng likido ang refractive index nito, na lumilikha ng epekto ng thermal lens na nakakasira sa sinag ng insidente. Ang wavefront distortion na ito ay sinusukat ng CGM at pinoproseso gamit ang isang deconvolution algorithm upang makakuha ng tatlong-dimensional na pamamahagi ng temperatura sa likidong medium. Kung ang mga gintong nanoparticle ay pantay na ipinamamahagi sa kabuuan ng sample, ang pagmamapa ng temperatura ay maaaring gawin sa mga lugar na walang bacteria upang makagawa ng mas magagandang larawan, na kung minsan ay ginagawa natin. Ang reference na CGM na imahe ay nakuha nang walang pag-init (na may laser off) at pagkatapos ay nakunan sa parehong lokasyon sa imahe na may laser on.
Nakakamit ang dry mass measurement gamit ang parehong CGM camera na ginamit para sa temperature imaging. Ang mga imahe ng sangguniang CGM ay nakuha sa pamamagitan ng mabilis na paglipat ng sample sa x at y sa panahon ng pagkakalantad bilang isang paraan ng pag-average ng anumang inhomogeneity sa OT dahil sa pagkakaroon ng bakterya. Mula sa OT na mga larawan ng bakterya, ang kanilang biomass ay nakuha gamit ang isang ensemble ng mga imahe sa mga lugar na pinili gamit ang homemade segmentation algorithm ng Matlab (tingnan ang subsection na "Numerical code"), kasunod ng pamamaraang inilarawan sa ref. 48. Sa madaling salita, ginagamit namin ang ugnayang \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}y\), kung saan ang \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) ay ang optical depth na imahe, ang \(m\) ay ang tuyong timbang at \({{{{\rm{\alpha }}}}}}\) ay pare-pareho. Pinili namin ang \({{{{\rm{\alpha))))))=0.18\) µm3/pg, na isang tipikal na constant para sa mga buhay na selula.
Ang isang cover slip na 25 mm ang lapad at 150 µm ang kapal na pinahiran ng gintong nanoparticle ay inilagay sa isang AttofluorTM chamber (Thermofisher) na ang mga gold nanoparticle ay nakaharap sa itaas. Ang Geobacillus stearothermophilus ay na-preculture nang magdamag sa LB medium (200 rpm, 60°C) bago ang bawat araw ng mga eksperimento. Ang isang patak ng 5 µl ng isang suspensyon ng G. stearothermophilus na may optical density (OD) na 0.3 hanggang 0.5 ay inilagay sa isang cover slip na may gintong nanoparticle. Pagkatapos, ang isang round cover slip na 18 mm ang lapad na may butas na 5 mm ang diameter sa gitna ay ibinagsak sa drop, at 5 μl ng bacterial suspension na may parehong optical density ay paulit-ulit na inilapat sa gitna ng butas. Ang mga balon sa mga coverlip ay inihanda alinsunod sa pamamaraang inilarawan sa ref. 45 (tingnan ang Karagdagang Impormasyon para sa karagdagang impormasyon). Pagkatapos ay magdagdag ng 1 ml ng LB medium sa coverslip upang maiwasang matuyo ang likidong layer. Ang huling coverslip ay inilalagay sa ibabaw ng saradong takip ng Attofluor™ chamber upang maiwasan ang pagsingaw ng medium sa panahon ng incubation. Para sa mga eksperimento sa pagtubo, gumamit kami ng mga spores, na, pagkatapos ng maginoo na mga eksperimento, kung minsan ay sakop ang tuktok na coverslip. Ang isang katulad na pamamaraan ay ginamit upang makakuha ng Sulfolobus shibatae. Tatlong araw (200 rpm, 75 ° C) ng paunang paglilinang ng Thiobacillus serrata ay isinagawa sa medium 182 (DSMZ).
Ang mga sample ng gold nanoparticle ay inihanda ng micellar block copolymer lithography. Ang prosesong ito ay inilarawan nang detalyado sa Chap. 60. Sa madaling sabi, ang mga micelle na nakapaloob sa mga gold ions ay na-synthesize sa pamamagitan ng paghahalo ng copolymer sa HAuCl4 sa toluene. Ang nalinis na mga coverslip ay inilubog sa solusyon at ginagamot ng UV irradiation sa presensya ng isang reducing agent upang makakuha ng mga buto ng ginto. Sa wakas, ang mga buto ng ginto ay lumago sa pamamagitan ng pakikipag-ugnay sa isang coverslip na may tubig na solusyon ng KAuCl4 at ethanolamine sa loob ng 16 minuto, na nagresulta sa isang quasi-periodic at napaka-unipormeng pag-aayos ng non-spherical gold nanoparticle sa malapit na infrared.
Upang i-convert ang mga interferogram sa mga OT na imahe, gumamit kami ng isang homemade algorithm, gaya ng nakadetalye sa link. 33 at available bilang Matlab package sa sumusunod na pampublikong imbakan: https://github.com/baffou/CGMprocess. Maaaring kalkulahin ng package ang intensity at OT na mga imahe batay sa mga naitalang interferograms (kabilang ang mga reference na larawan) at mga distansya ng array ng camera.
Upang kalkulahin ang pattern ng phase na inilapat sa SLM upang makakuha ng isang naibigay na profile ng temperatura, gumamit kami ng dati nang binuo na homemade algorithm39,42 na available sa sumusunod na pampublikong imbakan: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. Ang input ay ang gustong field ng temperatura, na maaaring itakda nang digital o sa pamamagitan ng monochrome bmp na imahe.
Upang i-segment ang mga cell at sukatin ang kanilang dry weight, ginamit namin ang aming Matlab algorithm na na-publish sa sumusunod na pampublikong repository: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. Sa bawat larawan, dapat mag-click ang user sa bacteria o mCFU ng interes, ayusin ang sensitivity ng wand, at kumpirmahin ang pagpili.
Para sa karagdagang impormasyon sa disenyo ng pag-aaral, tingnan ang abstract ng Ulat sa Pananaliksik sa Kalikasan na naka-link sa artikulong ito.
Ang data na sumusuporta sa mga resulta ng pag-aaral na ito ay makukuha mula sa kani-kanilang mga may-akda sa makatwirang kahilingan.
Ang source code na ginamit sa pag-aaral na ito ay detalyado sa seksyong Mga Paraan, at ang mga bersyon ng debug ay maaaring ma-download mula sa https://github.com/baffou/ sa mga sumusunod na repositoryo: SLM_temperatureShaping, CGMprocess, at CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Insight sa mga thermophile at ang kanilang malawak na spectrum na mga aplikasyon. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Insight sa mga thermophile at ang kanilang malawak na spectrum na mga aplikasyon.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. at Sharma, AK Pangkalahatang-ideya ng mga thermophile at ang kanilang malawak na aplikasyon. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用。 Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. at Sharma AK Isang malalim na pag-unawa sa mga thermophile at malawak na hanay ng mga aplikasyon.3 Biotechnology 6, 81 (2016).
Oras ng post: Set-26-2022